تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة
Summary
يصف لنا بروتوكول لتكاثر توليد وهادئة الليفية الجلدية البشرية الأولية، رصد معدلات تسوس نسخة، وتحديد الجينات الأثران المتحللة.
Abstract
التتابع هو حالة مؤقتة، وعكسها فيها الخلايا توقف انقسام الخلية، ولكن الاحتفاظ بقدرة على الانتشار. أظهرت دراسات متعددة، بما في ذلك بلدنا، أن التتابع يرتبط بالتغيرات الواسعة النطاق في التعبير الجيني. بعض هذه التغييرات التي تحدث من خلال أحداث تغييرات في مستوى أو النشاط من العوامل المرتبطة بانتشار النسخ، مثل E2F وحركة. لقد أظهرنا أن تسوس مرناً يمكن أن يسهم أيضا في التغييرات في التعبير الجيني بين الخلايا المتكاثرة وهادئة. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الإجراء الخاص بإنشاء ثقافات الليفية القلفة الجلدي البشرية المتكاثرة وهادئة. ثم يصف لنا إجراءات تمنع النسخ الجديدة في الخلايا المتكاثرة وهادئة مع والاكيتنوميسين د (أكتد). العلاج ActD يمثل نهجاً واضحة واستنساخه إلى الناي بالنسخ الجديدة من تسوس نسخة. عيب أكتد في المعاملة أن مسار الوقت يجب أن تكون محدودة بفترة زمنية قصيرة لأن أكتد يؤثر على بقاء الخلية. يتم رصد مستويات نسخة على مر الزمن لتحديد معدلات تسوس نسخة. يسمح هذا الإجراء لتحديد الجينات و isoforms الذي يحمل تسوس التفاضلية في تكاثر مقابل الليفية هادئة.
Introduction
مستويات الدولة ثابت النصوص تعكس مساهمة توليف محاضر والانحلال نسخة. وينظم واضمحلال نص منسق إليه هامة للتحكم في العمليات البيولوجية1،2،،من34. على سبيل المثال، قد ثبت معدلات تسوس نسخة للمساهمة في سلسلة الأحداث التي أعقبت التنشيط الزمانية ب عامل نخر الورم سيتوكين التحريضية5.
وقد أظهرنا سابقا أن الانتقال بين الانتشار والتتابع في الخلايا الليفية البشرية الأساسي يرتبط بالتغيرات في مستويات العديد من الجينات6نسخة. بعض هذه التغييرات تعكس الاختلافات في نشاط عوامل النسخ بين هاتين الدولتين.
التغيرات في معدل الانحلال على نسخة يمكن أن يسهم أيضا في التغييرات في مستوى التعبير نسخة في دولتين مختلفتين هما7،8. استناداً إلى نتائج الدراسة السابقة أن الانتقال بين الانتشار والتتابع يرتبط ارتباطاً بالتغيرات في مستويات متعددة ميكرورناس9، سألنا عما إذا كانت هناك أيضا مساهمة من تسوس نسخة التفاضلية في التغيرات التي طرأت على التعبير الجيني في تكاثر مقابل الليفية هادئة.
من أجل مراقبة استقرار نسخة، عقدنا العزم معدل انحلال نصوص على نطاق الجينوم في تكاثر مقابل خلايا هادئة. لتحقيق هذا الهدف، علينا رصد معدلات تسوس في تكاثر مقابل الليفية هادئة بالأخذ المانع للنسخ الجديدة ورصد معدل الذي اختفى النصوص الفردية على مر الزمن. وميزة هذا النهج هو أنه، مقارنة بالأساليب التي ترصد عموما التعبير الجيني، ببساطة عن طريق تثبيط توليف نسخة جديدة، سوف نكون قادرين على تحديد معدل الانحلال لهذه النصوص بشكل منفصل عن المعدل الذي هم نسخها.
العلاج ActD تمنع النسخ الجديدة وتحديد معدلات تسوس نسخة طبق بنجاح في دراسات سابقة متعددة. وقد استخدمت ActD تشريح أهمية استقرار الجيش الملكي النيبالي في التغييرات في نسخة الوفرة التي تنجم عن المعاملة مع السيتوكينات الالتهابية برو5. وقد استخدمت أيضا نهجاً مماثلاً تشريح الفروق في معدل تسوس نسخة في تكاثر مقابل المتباينة C2C12 الخلايا كما أنها تعتمد على النمط الظاهري العضلات متمايزة10. وكمثال آخر، كما تم اكتشاف عالمي مرناً التنصيف في pluripotent والخلايا الجذعية الجنينية الماوس المختلفة11. في هذه الأمثلة، أظهرت مرناً تسوس هامة لتنظيم محضر وفرة وانتقال الخلايا إلى خلية مختلف الدول.
تطبيق الأساليب المذكورة أدناه، اكتشفنا التغيرات في معدلات تسوس نسخة في ما يقرب من 500 الجينات عند مقارنة الليفية في الدول المتكاثرة وهادئة12. على وجه الخصوص، فقد اكتشفنا أن الأهداف التي ميكرورنا مير-29، ودوونريجولاتيد في خلايا هادئة، استقرت عند انتقال الخلايا بالتتابع. يصف لنا هنا المنهجية التي نحن المستخدمة في تحديد معدلات تسوس في الخلايا المتكاثرة وهادئة. هذه المنهجية مفيدة لمقارنة العالمية معدلات تسوس مرناً في اثنين متميزة لكن ظروف مماثلة عند التماس معلومات عن سرعة المتحللة الجينات. ويمكن استخدامه أيضا لمعالجة مسائل أخرى مثل التأثير شروط ثقافة الخلية على اضمحلال نص، على سبيل المثال، في اثنين من الأبعاد مقابل الثقافات الأبعاد الثلاثة. معدلات تسوس يمكن أن تكون مصممة على نطاق الجينوم مع أساليب مثل [ميكروارس] أو ما يليها الحمض النووي الريبي “بدلاً من ذلك”، قبكر في الوقت الحقيقي أو النشاف شمال يمكن استخدامها لتحديد معدلات تسوس على أساس الجينات بالجينات أو إيسوفورم من إيسوفورم. ثم يمكن استخدام هذه المعدلات لحساب نصف عمر كل الجينات رصد وتحديد الجينات مع اضمحلال معدلات مختلفة في هذين الشرطين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يكون التتابع الناجم عن إشارات خارجية بما في ذلك الانسحاب من ميتوجينس أو مصل الدم، وعدم التصاق الخلايا، وتثبيط الاتصال. تثبيط الاتصال، واحدة من العديد من الأساليب الممكنة لحمل التتابع، هو عملية عالية تقحم حفظت فيها الخلايا إنهاء دورة الخلية التكاثري ردا على خلية لخلية الاتصال. نحن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان HAC الباحث ميلتون هاء كاسل مؤسسة ألن ريتا (http://www.ritaallenfoundation.org). تم تمويل هذا العمل بالمنح إلى HAC من مركز المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة لمنح الامتياز P50 GM071508 (ديفيد بي بوتستين)، مؤسسة PhRMA منحة 2007RSGl9572، مؤسسة وطنية العلم OCI منحة 1047879 لديفيد آب/أغسطس، المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم R01 GM081686، المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R01 GM0866465، إيلي & أديت واسع مركز الطب التجديدي & بحوث الخلايا الجذعية، مركز الصحة/جامعة كاليفورنيا كتسي المعاهد الوطنية للصحة كانتور قزحية العين للمرأة منحة UL1TR000124، وجمعية اللوكيميا اللمفاوية. وأيد البحث عنها في هذا المنشور المعهد الوطني للسرطان من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم P50CA092131. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. HAC وعضو إيلي & “أديت مركز واسع للطب التجديدي” & بحوث الخلايا الجذعية ومعهد البيولوجيا الجزيئية في جامعة كاليفورنيا وجامعة كاليفورنيا المعلوماتية البرنامج المشترك بين الإدارات.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
