संशोधित रोलर ट्यूब विधि के लिए ठीक स्थानीयकृत और दोहराए आंतरायिक इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइस की लंबी अवधि के दौरान एक संलग्न प्रणाली में संस्कृति
Summary
यहां प्रस्तुत संवर्धन और photoetched coverslips पर सटीक reपोजिशनिंग के साथ कई हफ्तों से अधिक कुतर मस्तिष्क स्लाइस के आंतरायिक उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक संशोधित रोलर ट्यूब विधि है । न्यूरॉन व्यवहार्यता और स्लाइस आकृति विज्ञान अच्छी तरह से बनाए रखे हैं. सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए वायरस का उपयोग कर इस पूरी तरह से संलग्न प्रणाली के आवेदन प्रदान की जाती हैं ।
Abstract
कल्चरल कुतर ब्रेन स्लाइसर न्यूरॉन्स और glia के सेलुलर और आणविक व्यवहार के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं जो एक ऐसे वातावरण में होते हैं जो वीवो इंटरैक्शन में उनके सामान्य से कई बनाए जाते हैं. ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की एक किस्म या वायरल वैक्टर के उपयोग से प्राप्त स्लाइसें की अभिव्यक्ति के लिए फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन या रिपोर्टर जंगली प्रकार में मस्तिष्क स्लाइसें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं । कई तरीकों इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइस के लिए विकसित किया गया है, हालांकि लंबे समय अवधि के दौरान लाइव स्लाइस में विशिष्ट कोशिकाओं के दोहराव उच्च संकल्प इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ टुकड़ा संस्कृति के संयोजन समस्याओं उत्पंन है । यह विशेष रूप से सच है जब वायरल वैक्टर exogenous प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है के बाद से यह सबसे अच्छा एक बंद प्रणाली में किया जाता है उपयोगकर्ताओं की रक्षा और पार संक्रमण को रोकने के । सरल रोलर ट्यूब मस्तिष्क स्लाइस संस्कृति विधि है कि एक संलग्न प्रणाली में कई हफ्तों से अधिक स्लाइस के दोहराव उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति के लिए किए गए संशोधनों की सूचना दी है । photoetched coverslips पर संवर्धन स्लाइसें तेजी से और ठीक करने के लिए फिड्यूशियल के निशान का उपयोग परमिट समय से पहले और अलग उपचार के बाद छवि को समान क्षेत्र के लिए मंच की स्थिति । उदाहरण इस विधि के उपयोग के लिए विशिष्ट ंयूरॉंस धुंधला और अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त हिप्पोकैम्पस स्लाइस वास्तुकला में परिवर्तन का पालन करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वायरल मध्यस्थता न्यूरॉन अभिव्यक्ति, और cofilin विकृति के विकास के लिए दिखाए जाते हैं, जो पहले oligomers amyloid-β (Aβ) पेप्टाइड के साथ स्लाइस उपचार के जवाब में अल्जाइमर रोग (AD) के हिप्पोकैंपस में मनाया गया था ।
Introduction
असंबद्ध ंयूरॉंस की प्राथमिक संस्कृति कुतर मस्तिष्क के क्षेत्रों से शोधकर्ताओं द्वारा प्रयोग किया जाता एक महत्वपूर्ण उपकरण रोग फंसा उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं का पालन है । हालांकि, इस तरह के अध्ययनों से केवल 2d में और उनके glial समर्थन प्रणाली के बिना ंयूरॉंस में देखने का नुकसान है । इसके अलावा, जब तक बहुत उच्च घनत्व की शर्तों के तहत हो (६४० ंयूरॉंस/mm2 या सतह क्षेत्र के बारे में 16%) जिसमें यह एक dendrite या axon के यादृच्छिक वृद्धि का पालन करने के लिए अपने सेल शरीर से एक छोटी दूरी से अधिक के लिए असंभव हो जाता है, हिप्पोकैम्पस 4 सप्ताह से अधिक न्यूरॉन व्यवहार्यता काफी1गिरावट आती है, उम्र से संबंधित विकृतियों के विस्तारित अध्ययन के लिए असंबद्ध संस्कृतियों के उपयोग को सीमित. कुतर मस्तिष्क से तैयार स्लाइस की संवर्धन एक आकर्षक विकल्प है जो हफ्तों या महीनों के लिए एक संगठित सेल वास्तुकला और व्यवहार्यता को बनाए रखने के द्वारा इन सीमाओं पर काबू पाता है । स्लाइस संस्कृति में कुतर मस्तिष्क के कई विभिंन क्षेत्रों को बनाए रखने के लिए शर्तें2वर्णित किया गया है ।
दो प्रमुख तरीकों व्यापक रूप से मस्तिष्क स्लाइस की लंबी अवधि के संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: हवा में झिल्ली पर संवर्धन-तरल इंटरफेस3 या सील ट्यूबों में coverslips पर संवर्धन को वातन4प्रदान करने के लिए एक रोलर मशीन में घुमाने की अनुमति दी । झिल्ली पर कल्चरित स्लाइसें सीधे उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और पानी विसर्जन उद्देश्यों5का उपयोग कर के साथ imaged किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, स्लाइस झिल्ली पर प्रसंस्कृत गिलास नीचे व्यंजन को हस्तांतरित किया गया है वृक्ष के अच्छे संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्पिन6. हालांकि, इमेजिंग झिल्ली पर हो स्लाइस के दोनों तरीकों खुले सिस्टम है कि मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता होती है और अक्सर रोधी और/या एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग रोकने के लिए या दूषित5,6को कम । हवा मध्यम अंतरफलक पर एक झिल्ली पर स्लाइसें उत्कृष्ट आकृति विज्ञान और अस्तित्व को बनाए रखने, लेकिन उच्च आवर्धन पर दोहराव इमेजिंग के दौरान सटीक स्थानों के लिए लौटने अत्यंत कठिन है जब तक प्रयोग कोशिकाओं के केवल छोटे समूहों का पालन है एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त । हालांकि झिल्ली पर बड़े हो गए transgenes के वायरल मध्यस्थता अभिव्यक्ति के साथ इस्तेमाल किया गया है5,6, एक संलग्न संस्कृति प्रणाली के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि कुछ वायरल वैक्टर के लिए नियोजित किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन और सेल फिजियोलॉजी के पत्रकारों को व्यक्त । इसके अलावा, विसर्जन उद्देश्यों के नमूने है कि संस्कृति में5के बाद किया जाएगा के बीच संदूषण की आवश्यकता होती है । एक झिल्ली इंटरफेस संस्कृतियों के प्रमुख आवेदन उच्च संकल्प इमेजिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ एक समय अंक7पर संयोजन है ।
प्लास्टिक ट्यूब के अंदर coverslips के साथ रोलर ट्यूब विधि coverslip को हटाने के बिना किसी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति नहीं है । इस प्रकार, यह विधि सबसे अधिक बार लंबी अवधि के अध्ययन के लिए लागू की गई है जिसमें पद-निर्धारण टिप्पणियों को८बनाया गया है. यहां वर्णित एक तरीका है कि रोलर ट्यूब संस्कृति तकनीक का इस्तेमाल लेकिन coverslips पर स्लाइस के साथ drilled बाहर ट्यूबों कि दोहराया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में संस्कृतियों बनाए रखा जाता है । संलग्न प्रणाली इमेजिंग के लिए कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता है और उपयोग photoetched coverslips फिड्यूशियल के निशान है कि उच्च आवर्धन पर इमेजिंग की अनुमति प्रदान करने के लिए, दिनों या हफ्तों के बाद, सटीक पहले imaged क्षेत्रों ।
हम इस विधि को कुतर हिप्पोकैंपस, स्मृति और सीखने में शामिल एक प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्र में परिवर्तन की जांच करने के लिए लागू होते हैं । कुतर हिप्पोकैंपस अक्सर संज्ञानात्मक हानि के विकास के दौरान मनाया रोग या उम्र से संबंधित परिवर्तन के लिए एक मॉडल के रूप में अध्ययन किया जाता है9, जैसे कि विज्ञापन में होते हैं । हमारी विधि विशेष रूप से अच्छी तरह से रोग परिवर्तन है कि पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में समय के साथ एक टुकड़ा के भीतर विकसित अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, Aβ पेप्टाइड्स में वृद्धि के रूप में, जो विज्ञापन की विशेषता है8. मानव और मूषक विज्ञापन मस्तिष्क के साथ जुड़े एक विकृति cofilin-actin समुच्चय और छड़ की उपस्थिति है, जिसमें cofilin और actin एक 1:1 दाढ़ अनुपात में कर रहे है तंतुओं के बंडल युक्त उत्तरार्द्ध10,11, 12. छड़ Aβ उपचार के बाद चूहे हिप्पोकैंपस के निश्चित स्लाइस में मनाया गया है, साथ ही साथ एक जीवित कुतर मस्तिष्क टुकड़ा व्यक्त cofilin-GFP हाइपोक्सिया8के अधीन है, और वे विज्ञापन में देखा synaptic शिथिलता के लिए योगदान कर सकते है और स्ट्रोक । यहां हम इस नए संवर्धन विधि का उपयोग करने के लिए व्यक्त exogenous chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन अलग वायरस द्वारा शुरू की स्लाइस के भीतर समय पाठ्यक्रम और वितरण का पालन करें । हम तो एक cofilin रिपोर्टर के ंयूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति का उपयोग घुलनशील Aβ oligomers (Aβo) के साथ उपचार के जवाब में हिप्पोकैम्पस स्लाइस में cofilin रॉड और समग्र विकृति के विकास का पालन करने के लिए निर्माण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोलर ट्यूब विधि यहाँ वर्णित लंबी अवधि के संवर्धन और कटा हुआ मस्तिष्क ऊतक के उच्च संकल्प लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । स्लाइस तकनीक के रूप में यहां लागू के साथ एक प्रमुख मुद्दा स्लाइस के बढ़ते और ?…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
