Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

Summary

Métodos de detección de rutina utilizando amplificación del genoma viral están limitados por su incapacidad para discriminar infecciosas de partículas no infecciosas. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para métodos alternativos facilitar la discriminación de las partículas infecciosas norovirus con aptámeros vinculante, dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión.

Abstract

Norovirus humano exige salud pública considerable y las pérdidas económicas en todo el mundo. En vitro avances de cultivo no son todavía aplicables para la detección rutinaria del virus. Detección de corriente de las técnicas de cuantificación, que dependen sobre todo de amplificación de ácidos nucleicos, no discriminan infecciosas de partículas virales no infecciosas. El propósito de este artículo es presentar detalles específicos sobre avances recientes en técnicas que se usan juntos con el fin de adquirir más información sobre el estado de la infectividad de las partículas virales. Una técnica consiste en evaluar atascamiento de un aptámero de ssDNA de norovirus a la cápsida. Los aptámeros tienen la ventaja de ser fácilmente sintetizada y modificada y son baratas y estables. Otra técnica, dinámica, dispersión de luz (DLS), tiene la ventaja de observar el comportamiento de la cápside en la solución. La microscopia electrónica permite la visualización de la integridad estructural de la cápsida viral. Aunque prometedor, existen algunos inconvenientes de cada técnica, como aptámeros inespecífica Unión a moléculas de carga positiva en matrices de muestra, requisito de cápside purificada para DLS y la sensibilidad pobre para microscopía electrónica. Sin embargo, cuando se utilizan estas técnicas en combinación, el cuerpo de datos proporciona una información más completa en la integridad de la cápside de norovirus que puede usarse para inferir la infectividad, información que es esencial para la evaluación precisa de métodos de inactivación o la interpretación de la detección de virus. Este artículo proporciona protocolos para que el uso de estos métodos para diferenciar las partículas infecciosas de norovirus humanos.

Introduction

Norovirus humano es responsable de una carga considerable de salud pública a nivel mundial, causando unos 685 millones de enfermedades y 212.000 muertes anualmente¹, a un costo en miles de millones de dólares^2,3. Hoy, la cuantificación y detección de norovirus implica amplificación del genoma y las plataformas de ligando. El anterior se prefiere generalmente, ya que es más sensible, proporciona información cuantitativa y tiene generalmente un menor riesgo de falsos positivos⁴. La técnica más común norovirus detección y cuantificación genoma amplificación es reacción en cadena cuantitativa de polimerasa de la transcriptasa reversa (RT-qPCR). Porque apunta y amplifica un segmento pequeño del genoma humano norovirus, RT-qPCR solo no es capaz de discriminar entre infecciosos y partículas no infecciosas, como RNA genómico gratis, dañaron cápsida que contiene genomas y cápsida con fatalmente genomas mutados/trunca todavía pueden ser amplificados por RT-qPCR. Mientras que recientemente se han reportado dos nuevos en vitro técnicas de cultivo para norovirus humano^5,6 , todavía confían en RT-qPCR para la cuantificación del virus y todavía no son métodos viables para la rutina clínica y ambiental pruebas para los norovirus humanos. Así, RT-qPCR sigue siendo el estándar de oro para la prueba clínica y ambiental.

Otros métodos en vitro se han desarrollado en un esfuerzo para estimar mejor el estado de infectividad de las partículas de norovirus. Estos métodos se pueden categorizar generalmente como los que abordan la integridad de la cápside de norovirus y los evaluar la integridad del genoma. El enfoque anterior es más popular. Un método comúnmente usado es el pretratamiento de Rnasa antes de la extracción de ARN genómico viral, sin embargo esto no se da cuenta de las partículas virales que permanecen intactas, pero carecen de la capacidad de enlazar host receptores/co-factores, así como partículas virales que fatalmente han mutado o han truncado o ligeramente dañados genomas⁷. Integridad de la cápside puede ser evaluado basado en la capacidad del virus para enlazar a norovirus humano co-receptor/co-factores, que es hidratos de carbono conocidos como antígenos del grupo histo-sanguíneo (HBGAs). HBGAs están presentes en las células epiteliales intestinales del huésped como parte de glicoproteínas o glicolípidos (entre varios otros tejidos) y pueden ser secretadas en los líquidos corporales como saliva. Bacterias entéricas que contengan sustancias de HBGA-como en sus superficies ha demostrado para atar norovirus humano^8,9,10, y estas interacciones pueden promover infección de norovirus⁵. El concepto básico de utilizar el enlace de HBGA es que sólo las partículas virales capaces de atar el supuesto receptor/co-factor sería capaces de infectar las células. Múltiples estudios sugieren que el enlace de HBGA basado en el grano antes de amplificación de ácidos nucleicos es un método prometedor para infectividad discriminación^{11,12,13,14, 15,16}. Un reto importante en cuanto a HBGAs es que no solo tipo HBGA puede enlazar todos los genotipos de norovirus humanos. Para abordar esto, mucina gástrica porcina, que contiene HBGAs, se ha utilizado en lugar de carbohidratos HBGA purificadas en aras de la facilidad de síntesis, coherencia y un coste reducido.

Una publicación reciente por Moore et al. ¹⁷ introdujo una serie de nuevas técnicas para estimar la integridad de la cápside de norovirus humanos. En lugar de HBGAs, Moore et al. ¹⁷ investiga la Unión de un ácido nucleico ampliamente reactivo aptámeros (M6-2)¹⁸ y ampliamente reactivo anticuerpo monoclonal (NS14)¹⁹ para tratamiento térmico cápsida de norovirus GII.4 Sydney (virus-como partículas o VLPs) y esto en comparación con el atascamiento a HBGAs sintético. Ácido nucleico aptámeros son cortas (~ 20-80 nt) solo trenzado ácidos nucleicos (ssDNA o ARN) que doblan en estructuras tridimensionales únicas como consecuencia de su secuencia y unen un objetivo. Porque son ácidos nucleicos, son menos costosos; fácilmente químicamente sintetizado, purificado y modificado; y estable al calor. Existen varios informes de aptámeros generados contra los norovirus, con algunos de ellos mostrando amplia reactividad a una variedad de cepas^18,20,21,22. Por ejemplo, Moore et al. ¹⁷ demostró aptámeros M6-2 limitado a norovirus humano purificado, montado cápsida (VLPs) y se comportó de manera similar a HBGA en la dependencia de la cápside viral para mantener la estructura de la proteína de más alto orden (por ejemplo, secundario y terciario) para Enlace a ocurrir. Por otro lado, una proporción significativa de atascamiento de VLP de norovirus a anticuerpo NS14 permanecía después de cápsida fueron totalmente desnaturalizado. Evaluación de enlace de norovirus en el estudio realizado por Moore et al. ¹⁷ se hizo mediante un método simple, basado en la placa similar al ELISA, con la excepción que los aptámeros se utilizan en lugar de anticuerpos (por lo tanto, el método fue llamado ELASA). Este método experimental de alto rendimiento se utilizó para evaluar los efectos de diferentes tratamientos en la cápside de norovirus, trabajo que es valioso para comprender el mecanismo de inactivación viral sobre la exposición a factores estresantes físicos o químicos. Sin embargo, una desventaja a este método es la baja sensibilidad y falta de tolerancia para contaminantes matriz asociada a niveles más altos causantes de fijación no específica de aptámeros.

Moore et al. ¹⁷ utilizar otro método, dispersión de luz dinámica (DLS), para controlar la agregación de partículas virales en la respuesta al tratamiento térmico. DLS es comúnmente usado para evaluar el tamaño de las suspensiones de nanopartículas y se ha extendido a las proteínas^23,virus y^{24 25,26,27}. La intensidad de luz dispersada por las partículas en la solución varía en función del tamaño de partícula, lo que permite el cálculo del coeficiente de difusión y diámetro de partícula usando fórmulas establecidas. La técnica DLS puede distinguir entre el diámetro hidrodinámico de las partículas dispersas hasta la nanoescala, que permite la detección de virus dispersos, proteínas de la cápsida individuales o dímeros y agregados de virus basados en tamaño²⁷. Agregación de virus, representada por un aumento de tamaño de partícula, es indicativa de pérdida de la integridad de la cápside. La cápside es desnaturalizada y perturbado de su estructura, residuos hidrofóbicos verse expuestas y hacen que las partículas a pegarse y formar agregados. DLS puede utilizarse para medir el tamaño de las partículas después de un tratamiento determinado o la cinética de la agregación en tiempo real^17,28. Este método tiene la ventaja de permitir la observación del comportamiento de la cápside en solución pero requiere altas concentraciones de purificada cápside, que puede no ser totalmente representativos de los virus en su estado natural.

El último método utilizado por Moore et al. ¹⁷ fue la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Aunque este método carece de sensibilidad y no produce datos cuantitativos, permite la visualización de los efectos de diferentes tratamientos sobre la estructura de la cápside viral. Aunque no es todavía ideal para ajustes clínicos y ambientales, el uso de estos métodos en combinación es valioso en la comprensión de inactivación de norovirus humanos. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para el análisis de enlace basado en la placa (ELASA), DLS, y utilizar métodos de preparación de TEM para investigar los efectos de tratamientos térmicos en la cápside de norovirus en el contexto de los efectos de los tratamientos en la cápsida integridad que se presenta en Moore et al. ¹⁷.

Protocol

1. placa base vinculante ensayo para evaluación de pérdida de más alto orden Norovirus cápsida estructura Nota: un protocolo ELASA muy similar al presentado aquí ha sido publicado 29, y ensayos ELASA similares se han divulgado previamente como parte de la investigación en otros lugares artículos 17 , 18 , 22. Tratamiento térmico de cápsida de hu…

Representative Results

La integridad estructural de la cápsida de humano norovirus GII.4 Sydney (VLPs) se evaluó mediante varios métodos novela presentada por Moore et al. 17. en primer lugar, se realizó un experimento en que la integridad de la cápsida en función de su capacidad un supuesto receptor/co-factor (HBGA) o aptámeros ssDNA (M6-2) fueron comparados (figura 1). Los resultados mostrados anteriormente se presentan por Moore et al….

Discussion

El protocolo y las técnicas descritas aquí constituyen un medio de evaluar la cápside de norovirus humanos integridad/funcionalidad. Estos métodos pueden utilizarse para la obtención de la visión mecanicista de los efectos de los tratamientos de inactivación contra el virus y potencialmente pueden complementar los métodos tradicionales de evaluación de inactivación como ensayo de RT-qPCR o placa. Por ejemplo, la evaluación de inactivación química o física por el análisis de la placa solo proporciona una me…

Materials

Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate	Fisher (Costar)	07-200-36
Lid for 96-well plate	Thermo Fisher	3098
Paraffin film (Parafilm)	Thermo Fisher	PM999
1x PBS (pH 7.2)	Life Technologies	20012-050
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20	N/A	N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids	N/A	N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes	Genesee Scientific	22-154G
2 thermocyclers	Bio-Rad	1861096
Tabletop mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Skim milk solids	Thermo Fisher	LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated	Glycotech	01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004	Life Technologies	SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature	Thermo Fisher	50-76-00
1 M phosphoric acid	N/A	N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm	Tecan	Infinite m200 Pro
Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program	N/A	N/A
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument	Malvern Instruments	N/A
Vortex	Fisher Scientifc	02-215-365
Quartz cuvette	Hellma	104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use)	Malvern Instruments	ZEN0040
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film	Ladd Research	10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers	Ted Pella	5372-NM
Qualitative filter paper	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Glass petri dishes	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2)	N/A	N/A
2% uranyl acetate	N/A	N/A