मापने इंफ्लूएंजा को निष्क्रिय एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को एक (H3N2) मानव सीरा में Microneutralization परख द्वारा MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग कर वायरस
Summary
इंफ्लूएंजा बेअसर एंटीबॉडी इंफ्लूएंजा संक्रमण के संरक्षण के साथ सहसंबंधी बनाना । Microneutralization परख मानव सीरा में एंटीबॉडी को बेअसर उपाय है और अक्सर इंफ्लूएंजा मानव सीरोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया । हम एक microneutralization MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख समकालीन 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (titers) वायरस इंफ्लूएंजा टीकाकरण या संक्रमण के बाद एंटीबॉडी H3N2 बेअसर उपाय का वर्णन ।
Abstract
hemagglutinin के खिलाफ एंटीबॉडी बेअसर (हा) इंफ्लूएंजा वायरस के मुख्य प्रतिरक्षा तंत्र माना जाता है कि इंफ्लूएंजा संक्रमण के लिए सुरक्षा के साथ संबद्ध । Microneutralization (MN) परख अक्सर मानव सीरा में इंफ्लूएंजा टीकाकरण या संक्रमण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय उपाय किया जाता है । मादीने डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं MN परख के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल सब्सट्रेट हैं । हालांकि, वर्तमान में घूम 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (H3N2) इंफ्लूएंजा वायरस बदल रिसेप्टर बाध्यकारी विशिष्टता हासिल कर ली है । इस MDCK-SIAT1 सेल लाइन के साथ बढ़ α-2, 6 sialic गैलेक्टोज moieties सतह पर इन समकालीन ए (infectivity) वायरस के लिए पारंपरिक MDCK कोशिकाओं की तुलना में सुधार H3N2 और अधिक वफादार प्रतिकृतियां प्रदान करने के लिए सिद्ध किया है । यहां, हम एक MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं है कि इन समकालीन एक (H3N2) वायरस एंटीबॉडी titers को बेअसर करने के लिए अनुकूलित किया गया है का उपयोग परख का वर्णन । इस प्रोटोकॉल में, गर्मी निष्क्रिय एंटीबॉडी युक्त सीरा पहले प्रश्नपत्र पतला कर रहे हैं, तो १०० TCID५०इंफ्लूएंजा के एक (H3N2) वायरस के साथ मशीन के लिए सीरा में एंटीबॉडी को वायरस से बाइंड करने की अनुमति । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को फिर वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए जोड़ रहे हैं, और ३७ ° c, 5% CO2 पर 18-20 h के लिए तैयार करने के लिए एक (H3N2) वायरस MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति देते हैं । रातोंरात गर्मी के बाद, प्लेटें तय कर रहे है और एक अच्छी तरह से वायरस की मात्रा में एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) विरोधी का उपयोग कर मात्रा है इंफ्लूएंजा एक nucleoprotein (एनपी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी । बेअसर एंटीबॉडी titer वायरस infectivity के ≥ ५०% अवरोध प्रदान करता है कि उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक के रूप में परिभाषित किया गया है ।
Introduction
इंफ्लूएंजा वायरस के लिए हर साल मानव आबादी में रुग्णता और मृत्यु का कारण जारी है । हा इंफ्लूएंजा वायरस की प्रमुख सतह ग्लाइकोप्रोटीन है । एंटीबॉडी लक्ष्यीकरण हा बेअसर मुख्य प्रतिरक्षा तंत्र है कि इंफ्लूएंजा संक्रमण1,2के संरक्षण के साथ संबद्ध हैं । Hemagglutination निषेध (हाय) परख और MN परख दो व्यापक रूप से मानव सीरा में इंफ्लूएंजा संक्रमण या3टीकाकरण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं । हाय परख उपाय एंटीबॉडी लाल रक्त कोशिकाओं के वायरस hemagglutination के निषेध और एक किराए की परख माना जाता है । हाय के विपरीत, एमएन परख सीधे मानव सीरा में एंटीबॉडी के स्तर को मापने कर सकते है कि कोशिका संस्कृतियों में इंफ्लूएंजा संक्रमण बेअसर । MDCK कोशिकाओं को अक्सर इंफ्लूएंजा वायरस अलगाव और एमएन परख4में प्रयोग किया जाता है ।
इंफ्लूएंजा वायरस लगातार प्रतिजनी बहाव और बदलाव से गुजरना, हा प्रोटीन है कि वायरस के रिसेप्टर बाइंडिंग विशिष्टता को बदल सकते है पर उत्परिवर्तन प्राप्त । २०१४ के बाद से, एक (H3N2) वायरस के नए समूहों उभरा और मौजूदा मौसम तक प्रसारित करने के लिए जारी रखा । इन वायरस के अधिकांश आनुवंशिक समूह 3 सी. 2a और 3 सी. 3. के आधार पर वंशावली विश्लेषण के लिए कर रहे है हा प्रोटीन । परिसंचारी 3 सी. 2a वायरस के कई hemagglutinate लाल रक्त कोशिकाओं को कम करने की क्षमता थी और इसलिए हाय परख द्वारा विशेषता नहीं किया जा सकता है5। बेअसर परख इन वायरस है कि6hemagglutinate नहीं करने के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि इन समकालीन एक (H3N2) वायरस के पहले एक (H3N2) वायरस के साथ तुलना में रिसेप्टर बाइंडिंग गुणों को बदल दिया है और संस्कृति संचित उत्परिवर्तनों और बहुरूपता जब में पारित करने के लिए करते हैं इन विट्रो सेल संस्कृतियों7,8,9। पारंपरिक MDCK कोशिकाओं के साथ तुलना में, MDCK-SIAT1 Matrosovich एट अल द्वारा विकसित एक सेल लाइन है. मानव α2, 6-sialtransferase (SIAT1) के सीडीएनए के साथ MDCK कोशिकाओं के स्थिर अभिकर्मक के माध्यम से । यह सेल लाइन α2 की बढ़ी हुई मात्रा, 6-sialic गैलेक्टोज moieties और α2 की घटी हुई मात्रा, 3-sialic एसिड moieties पैरेंट MDCK कोशिकाओं से10की तुलना में व्यक्त करता है । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं MDCK कोशिकाओं11की तुलना में एक (H3N2) वायरस के लिए अलगाव की दर में सुधार करने के लिए दिखाया गया है । हाल ही में, लिन एट अल । ने बताया कि नई 3 सी के लिए उभरा. 2a और 3 सी. 3 ए मानव (H3N2) इंफ्लूएंजा वायरस, अधिक वफादार वायरस प्रतिकृतियां और बेहतर वायरस infectivity जब वायरस MDCK-SIAT1 सेल लाइनों में MDCK कोशिकाओं के साथ तुलना में कल्चरित थे प्राप्त किए गए थे7। इस प्रकार, MDCK-SIAT1 कोशिकाओं बेहतर MN परख में उपयुक्त है एक (H3N2) वायरस के हाल के समूहों को एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की विशेषता है ।
यहां हम एक MN MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का उपयोग परख का वर्णन करने के लिए समकालीन 3 सी. 2a और 3 सी. 3 ए (H3N2) मानव सीरा में वायरस एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए । या तो अंडे या कोशिकाओं में उगाया वायरस इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है । गर्मी निष्क्रिय एंटीबॉडी युक्त सीरा पहले प्रश्नपत्र पतला कर रहे हैं, तो १०० TCID५०/well इंफ्लूएंजा एक (H3N2) वायरस के साथ मशीन के लिए सीरा में एंटीबॉडी वायरस को बांधने की अनुमति । MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को फिर वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए जोड़ रहे हैं, और ३७ ° c, 5% CO2 पर 18-20 h के लिए मशीन के लिए अनुमति देने के लिए एक (H3N2) वायरस MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को संक्रमित और दोहराने । रात भर के बाद, प्लेटें तय कर रहे है और एक अच्छी तरह से वायरस की राशि एक विरोधी का उपयोग कर एलिसा द्वारा मात्रा है इंफ्लूएंजा एक एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी । एनपी का पता लगाने वायरस के संक्रमण की उपस्थिति और एंटीबॉडी बेअसर के अभाव को इंगित करता है । बेअसर एंटीबॉडी titer वायरस infectivity के ≥ ५०% अवरोध प्रदान करता है कि उच्चतम सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक के रूप में परिभाषित किया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
MN परख मुख्य परख इंफ्लूएंजा सीरोलॉजी के लिए इस्तेमाल के लिए इंफ्लूएंजा संक्रमण या टीकाकरण के बाद एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का पता लगाने में से एक है । Titers MN परख से उत्पंन अक्सर कई इंफ्लूएंजा seroepidemiology अध्ययन क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम dr. Xiuhua लू, डॉ फेंग लियू, और सुश्री एशले बरोज के लिए इस पांडुलिपि की तैयारी में उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा और सहायता के लिए सीडीसी प्रभाग के इंफ्लूएंजा से धंयवाद । हम चित्रा 3के ग्राफिक्स की तैयारी में उनकी सहायता के लिए सीडीसी के विभाजन से डॉ एड्रियन रेबर धंयवाद । अन्त में, हम MDCK-SIAT1 कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डॉ॰ एम. Matrosovich, Marburg, जर्मनी का धन्यवाद करते हैं ।
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
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