Измерения гриппа, нейтрализуя антитело ответы на A(H3N2) вирусов в человеческой сыворотки, Microneutralization Assays клетки с помощью MDCK-SIAT1
Summary
Гриппа нейтрализующих антител коррелируют с защитой гриппа инфекций. Microneutralization измерения нейтрализующих антител в человеческой сыворотки и часто используются для гриппа человека серология. Мы описываем microneutralization анализа с использованием клеток MDCK-SIAT1 для измерения нейтрализующие антитела титры для современных вирусов, 3C.2a и 3C.3a A(H3N2) после вакцинации против гриппа или инфекции.
Abstract
Нейтрализующие антитела против гемагглютинина (HA) вирусов гриппа, считаются основным иммунного механизма, который коррелирует с защитой для инфекции гриппа. Microneutralization (MN) анализы часто используются для измерения нейтрализующие антитела ответы в человеческой сыворотки после вакцинации против гриппа или инфекции. Клетки Madine Darby собак почек (MDCK) являются широко используемых ячеек субстрат для MN анализов. Однако в настоящее время циркулирует 3C.2a и 3C.3a A(H3N2) гриппа, которую приобрели вирусы изменена специфика связывания рецептора. MDCK-SIAT1 линия клетки с повышенной α-2,6 сиаловых галактозы постановление на поверхности оказалось обеспечить улучшение инфективности и более верным репликаций, чем обычные клетки MDCK для этих современных вирусов A(H3N2). Здесь мы описываем MN assay клетки MDCK-SIAT1, который был оптимизирован для количественного определения нейтрализации титры антител к этим современным A(H3N2) вирусов. В этом протоколе тепла инактивированная сера содержит нейтрализующие антитела являются впервые серийно разводили, затем инкубируют с 100 TCID50/хорошо A(H3N2) вирусов гриппа разрешить антител в сыворотке для привязки к вирусов. MDCK-SIAT1 клетки затем добавляется в смесь вирус антитела и инкубированы для 18-20 ч при 37 ° C, 5% CO2 разрешить A(H3N2) вирусов заразить клетки MDCK-SIAT1. После ночи инкубации, крепятся плиты и количество вируса в каждом хорошо количественно энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) с помощью противогриппозные Нуклеопротеиды (NP) моноклональные антитела. Нейтрализация титр антител определяется как взаимные высоких сыворотки разрежения, которая обеспечивает ≥50% ингибирования инфективности вируса.
Introduction
Вирусы гриппа по-прежнему вызывать заболеваемость и смертность населения каждый год. ГА является основной поверхности гликопротеина вирусов гриппа. Нейтрализующие антитела против га являются основным иммунного механизма, который коррелирует с защитой гриппа инфекция1,2. Два метода, широко используется для измерения реакции антитела в человеческой сыворотки после гриппа инфекции или вакцинации3гемагглютинации ингибирование (HI) анализов и MN анализов. HI меры ингибитирование антитела вируса гемагглютинации красных кровяных клеток и считается пробирного суррогат. В отличие от Привет MN assay может непосредственно измерить уровни антител в человеческой сыворотки, которые нейтрализуют инфекции гриппа в клеточных культурах. MDCK клетки часто используются в изоляции вируса гриппа и MN assays4.
Вирусы гриппа постоянно проходят антигенный дрейф и shift, приобретения мутации на HA белков, которые могут изменить рецептор привязки специфика вирусов. С 2014 года новые кластеры A(H3N2) вирусов возникли и продолжают циркулировать до текущего сезона. Большинство этих вирусов принадлежат генетические группы 3C.2a и 3C.3a на основе филогенетического анализа белков HA. Многие из циркулирующих вирусов 3C.2a снизили способность hemagglutinate красных кровяных клеток и поэтому не могут характеризоваться Привет анализов5. Нейтрализация анализов должны использоваться для измерения антитела ответы на эти вирусы, которые не hemagglutinate6. Кроме того исследования показали, что эти современные вирусы A(H3N2) изменили свойства привязки рецепторов, по сравнению с ранее A(H3N2) вирусов и имеют тенденцию накапливаться культуры адаптированы мутации и полиморфизм когда пассированной в ячейке в пробирке 7,культур8,9. По сравнению с обычными MDCK клеток, MDCK-SIAT1 является линия клетки, разработанный Матросович и др. Благодаря стабильной transfection клетки MDCK с cDNA человека α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Эта линия клетки выражает повышенных количествах α2, постановление 6-сиаловых галактозы и снижение количества α2, 3-сиаловых кислот постановление чем родительской клетки MDCK10. MDCK-SIAT1 клеток показали, чтобы улучшить показатели изоляции на вирусы A(H3N2), по сравнению с MDCK клеток11. Недавно, Линь и др. сообщили, что для вновь появившихся 3C.2a и 3C.3a человека A(H3N2) вирусов гриппа, более верным вирус репликаций и лучше инфективности вируса были достигнуты когда вирусы были культивировали в MDCK-SIAT1 клеточных линий по сравнению с MDCK клетки7. Таким образом MDCK-SIAT1 клетки лучше подходят в MN анализов характеризовать антитела ответы на последние кластеры A(H3N2) вирусов.
Здесь мы описываем пробирного MN, используя MDCK-SIAT1 клетки для измерения антитела ответы на современных 3C.2a и 3C.3a A(H3N2) вирусов в человеческой сыворотки. Вирусы, выращенных в яйца или клетки могут использоваться в этом assay. Тепла инактивированная сера содержит нейтрализующие антитела впервые серийно разводили, затем инкубируют с 100 TCID50/хорошо вируса гриппа A(H3N2) разрешить антител в сыворотке для привязки к вирусу. MDCK-SIAT1 клетки затем добавляется в смесь вирус антитела и инкубированы для 18-20 ч при 37 ° C, 5% CO2 разрешить A(H3N2) вирус заражает MDCK-SIAT1 клетки и репликации. После ночи инкубации пластины являются фиксированными и количество вируса в каждой скважине количественно, ELISA с использованием моноклональных антител против гриппа NP. Обнаружение NP указывает на наличие вирусной инфекции и отсутствие нейтрализующих антител. Нейтрализация титр антител определяется как взаимные высоких сыворотки разрежения, которая обеспечивает ≥ 50% ингибирования инфективности вируса.
Protocol
Representative Results
Discussion
MN assay является одним из основных анализов, используемые для гриппа серология для обнаружения антител реакции после инфекции гриппа или вакцинации. Титры, созданный из MN анализов часто используются как основной результат многих исследований Сероэпидемиология гриппа. MN анализов также ш…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Лу Xiuhua, доктор Фэн Лю и г-жа Эшли Берроуз в отделе гриппа CDC для их критического обзора и помощь в подготовке этой рукописи. Мы благодарим д-р Адриан Reber отдела гриппа CDC за его помощь в подготовке графика на рисунке 3. И наконец мы благодарим д-р M. Матросович, Марбург, Германия для обеспечения MDCK-SIAT1 клеток.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
