Семенных канальцах Сквош техника для цитологического анализа с помощью мыши модель сперматогенеза
Summary
Цель этой техники Сквош трубочку является быстро оценить цитологические особенности развивающихся сперматоцитах мыши при сохранении целостности клеточных. Этот метод позволяет для изучения всех этапов сперматогенеза и могут быть легко реализованы вместе с другими биохимических и молекулярных биологических подходов для изучения мыши мейоз.
Abstract
Meiotic прогрессии в мужчины является процессом, который требует согласованных действий ряда жестко регулируемых сотовой событий. Ошибки, возникающие во время мейоза может привести к бесплодию, потери беременности или генетические дефекты. Начиная с наступлением полового созревания и продолжается в зрелом возрасте, непрерывной полусинхронные волны сперматоцитах пройти сперматогенеза и в конечном счете формируют гаплоидным спермы. Первая волна мыши сперматоцитах переживает meiotic инициации появляются на 10 день после родов (10 ДПП) и выпускаются в просвете семенных канальцев как зрелые сперматозоиды в 35 dpp. Таким образом это выгодно использовать мышь в этой области развития промежуток времени с целью получения высокообогащенного населения интерес. Анализ этапов редких клетки является более сложным в старых мышей за счет вклада последовательных генерациями волн, которые увеличивают разнообразие клеточных популяций в трубочки. Метод, описанный здесь легко реализована методика для цитологического оценки клетки, находящиеся в пределах семенных канальцев мышей, в том числе сперматогонии, сперматоцитах и сперматид. Трубочка Сквош техника обеспечивает целостность изолированные мужские половые клетки и позволяет изучение клеточных структур, которые не визуализируются легко с другими методами. Чтобы продемонстрировать возможности применения этой техники Сквош трубочку, шпинделя Ассамблея контролировали в сперматоцитах прогрессирует через профаза до метафазы, которую я переход (G2/ми переход). Кроме того Центросома дублирования, инактивирование meiotic секс хромосомы (МСКИ) и хромосомы букет формирования были оценены как примеры цитологического структур, которые можно наблюдать с помощью этого метода Сквош трубочку. Этот метод можно использовать для определить конкретные дефекты в ходе сперматогенеза, которые вызваны мутации или внешних возмущений, и таким образом, вносит вклад в наше понимание молекулярных сперматогенеза.
Introduction
Мейоз представляет собой комплекс сотовой событие, в котором один раунд репликации ДНК следуют два последовательных раундов клеточного деления. Несколько конкретных мейоз события должны быть скоординированы на начальных этапах мейоз для обеспечения точной хромосома сегрегации. Эти мероприятия включают в себя завершение гомологичных рекомбинации, Сопредседатель ориентации сестры kinetochores во время первого дивизиона meiotic и поэтапного потери когезинов комплексов для устранения chiasmata между гомолог. Точное регулирование этих процессов является необходимым для поддержания плодородия и предотвращения хромосоме missegregation события, которые могут привести к генетическими отклонениями и самопроизвольный выкидыш1.
Хотя основные события мейоз происходят у самцов и самок, значительные временные и механистические различия существуют между сперматогенеза и женских2. Например во время женского мейоз, профазе I происходит во время эмбрионального развития и аресты на dictyate этапе до полового созревания. В отличие от сперматогенез начинается в период полового созревания и прогрессирует в волны по всей взрослой жизни без ареста. Различия между мужской и женской мейоз подчеркивает необходимость разработки методов, которые специально рассчитаны на оценку этих процессов в сперматоцитах и яйцеклеток. В настоящее время оценки meiotic прогрессии во многом основывается на использовании хроматина распространяется3,4,5. Хотя хроматина спреды являются полезными для изучения meiotic хромосом, они сумеют сохранить целостность клеточных, предотвращая оценки клеточных структур, таких как шпинделя микротрубочек, большое, ядерная оболочка и теломер вложения. Живут изображений и долгосрочные культивирования методов значительно продвинулись нашего понимания женской мейоз; аналогичные подходы к визуализировать всю ячейку нетронутыми, однако, менее часто реализуются для исследования сперматогенеза6,7. Для того, чтобы визуализировать динамических событий всей мужской мейоз, мы адаптировали установленных трубочку Сквош методы быстро оценить цитологические особенности разработки мыши сперматоцитах8,9. Метод, описанный здесь поддерживает целостность клетки, позволяя изучение нескольких клеточных структур на различных этапах сперматогенеза.
Эта трубочка Сквош техника является клеточных подход, который позволяет для оценки клеточных структур через иммунофлуоресценции. Общие подходы гистологические визуализировать meiotic прогрессии у мышей-самцов, такие как гематоксилин и эозином парафина встроенных яичек, и immunofluorescent маркировки cryosections позволяют широкий обзор meiotic прогрессии. Однако эти методы не удается урегулировать отдельные ячейки в необходимом для детального анализа событий, происходящих на протяжении мейоз10,11. Альтернативные методы для визуализации meiotic процессов полагаться на значительные Хемиосмотическая нарушения Сперматоцит изолировать и исправить ядерных материалов3,4,5. Эти присадки препятствуют наблюдения клеток типов, отличных от основного сперматоцитах. Недавно описан метод Namekawa позволило исследовательского сообщества для сохранения ядерной Архитектура изолированных сперматоцитах, но требует использования cytospin и аксессуары, которые не могут быть легко доступны для некоторых лабораторий4. В противоположность этому техника Сквош трубочку только требует оборудования, обычно стандартный в большинстве лаборатории биологии клетки.
Трубочка Сквош метод, описанный здесь может использоваться для визуализации различных клеток типов, найденные в пределах семенных канальцах, включая клеток Сертоли, сперматогонии, первичных и вторичных сперматоцитах и сперматид. Путем соединения эту технику с рядом синхронная первой волной сперматогенеза у несовершеннолетних мышей, можно получить обогащенного популяции сперматогенных клеток, как они прогресс через мейоз12. Этот процесс позволяет подробный анализ процессов на протяжении сперматогенез, таких, как ранние события профаза, G2/ми и метафаза анафазе переходы, и spermiogenesis. Кроме того трубочка Сквош препаратов может использоваться для визуализации цитологические особенности хромосом (например, interchromatid домены (ВТС) и kinetochores) и большое (centrioles и pericentriolar материал/матрицы). Сквош метод может легко выполняться параллельно с другими экспериментальные подходы, такие как хроматина спреды и извлечения белков. Кроме того этот метод успешно изменен депозита живых сперматогенных клеток на слайдах для прямой визуализации13.
Метод, описанный здесь включает клеточных семенных канальцах Сквош способ анализа G2/ми переход в мышей C57BL/6J одичал типа. Цитологические особенности первичной сперматоцитах, введя в первый дивизион meiotic были визуализированы с иммунофлуоресценции соблюдать meiotic шпинделя. Этот универсальный метод могут быть легко изменены для визуализации другие meiotic этапов и различных типов клеток. Метод также поддаются стратегии альтернативных визуализации, такие как ДНК и РНК рыбы подходов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышей оказались организм полезной моделью для изучения клеточных события, которые управляют meiotic прогрессии в ходе сперматогенеза. Кроме того это необходимо разработать инструменты, обслуживали исследования сперматогенеза, потому что многие события, такие как выход из meiotic профаза, с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIGMS (R01GM11755) для P.W.J. и обучения Грант стипендий от Института национального рака (НИЗ) (CA009110) S.R.W. и. г.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
