線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド
Summary
ここで紹介した方法の目的は、線虫モデル有機体の正常な老化中タンパク質凝集を探索することです。プロトコルは、年齢を形成する非常に不溶解性の大きな凝集体を研究し、プロテオステイシスの変化により蛋白質の集合がどのような影響を与えるかを決定するための強力なツールを表します。
Abstract
最後の十年では、神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの有病率は成長しています。これらの加齢に伴う疾患はこれらの患者の頭脳の線維性構造タンパク質凝集体の出現によって特徴付けられます。通常水溶性タンパク質を受けるまさに、集計プロセスは不十分な理解のままになります。蛋白質の集合は病気プロセスに限定されない代わりに、正常な老化プロセスの一部により異所萌出へを使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムの研究発見表現人間疾患関連タンパク質。ここで相補的なアプローチを通じてカエノラブディティス ・ エレガンスにおける固有の蛋白質凝集を調べるための方法論について述べる。まず、高齢の動物を取得する時代同期のc. の elegansの大量に成長する方法について説明、提案する高い不溶性-大きな凝集体を分離する生化学的なプロシージャ。ターゲット遺伝子ノックダウンと組み合わせて、促進またはいずれか包括的な分析を用いた定量的質量分析法によって年齢依存した蛋白質の集合を防ぐことの興味の遺伝子の役割を分析することが可能だか、抗体の候補者ベースの分析。これらの調査結果、集計しやすい蛋白質の蛍光タグを表現するトランスジェニック動物を体内分析によるに確認します。これらのメソッドは、ある特定の蛋白質が加齢とともに集計と最終的にどのようにこれらの蛋白質を完全に機能しやすい理由を明確に役立つはずです。
Introduction
タンパクは、広告、PD、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、前頭側頭型認知症 (FTD)、および他の多くなどのいくつかの神経変性疾患の認刻極印として認識されます。例えば、運動ニューロンの変性の細胞質集合体を形成する ALS 患者 TDP 43 または FUS ミスフォールドタンパク中の PD 患者の黒質に特にレビー小体として蓄積するアミロイド線維に α シヌクレイン アセンブリ。それぞれのこれらの神経変性疾患、プロテオスタシス蛋白質の恒常性を維持するメカニズムが病気につながるそのため、誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を防ぐために失敗しました。
通常の条件の下でこれらの調節機構を厳密に制御タンパク質合成、折りたたみ、分解の率および細胞機能を確保するためプロテオステイシスが欠かせません。いくつかの研究は、高齢化、蛋白質の恒常性を維持するために多くの細胞や臓器の機能が徐々 に低下、年齢とプロテオステイシス ネットワークの生理的な老朽化はの重要な悪化要因を示す神経変性疾患 (参照1,2,3で確認)。タンパク質の品質管理と小胞体ストレス ストレスに対する細胞の反応が年齢に侵害されているという事実は、タンパクが老化の一般的な結果であることを示唆しています。確かに、我々 と他の示されている蛋白質の集合は病に制限されない、その代り、プロテオームの一部なる高い洗剤-不溶性高齢動物4,5,6,7 ,8,9,10。計算とin vivoの解析では、これらの生理学的な年齢関連の集計がいくつかの側面5疾患集計を似ているを明らかにしました。内因性、年齢依存した蛋白質の集合の発見は私たちに異所萌出へ表現されたひと疾患関連蛋白質を使用せずタンパク質凝集を調節する分子・細胞メカニズムを解剖する機会を与えます。現時点では、限られた情報のみが存在するは、広範なタンパク質の不溶の規制とこの破綻の生物の健康への影響について。
線虫C. elegansは、老化研究のこれらの動物は比較的短い寿命を持っているし、高い生物にみられる多くの特徴的な高齢化機能を表示、もっとも広範囲に研究のモデル生物の一つです。不溶性タンパク質の加齢の影響線虫病神経変性研究11 のフィールドに集計を抽出するために用いられている微分の溶解度に基づく逐次生化学分画によって研究されています。.定量的質量分析によるいくつかの百のタンパク質は、集計しやすい線虫病5の不在になること示されていた。ここで我々 は液体文化と西部のしみによって質量分析法と解析法による定量化のための集約された蛋白質を分離する逐次抽出にワームの大規模な番号を成長するプロトコルの詳細に説明します。高齢者の変性、集計しやすいタンパク質蓄積されていくので他の体細胞組織5,12,13 c. の elegans生殖腺およびマスク変更蛋白質の分析の焦点に生殖腺のない突然変異体を用いて非生殖ティッシュに不溶。提示方法 0.5 %sds で不溶性と比較的低い遠心速度によって小球形にされた高い不溶性、大きい総計の解析が可能。 にします。またより小さくとより可溶性凝集体を収集するほど厳しくない抽出プロトコルとなっていますまた、10を他の所で出版しました。さらに、凝集体内線虫の評価に使用する方法をについて説明します。
全体的にみて、RNA 干渉 (RNAi) との組み合わせで、これらのメソッドは、年齢依存した蛋白質の集合を調節することの興味の遺伝子の役割を評価できます。この RNAi を使用して興味の特定の蛋白質のノックダウンと若齢および老齢のワームからの抽出物の分析について述べる。これらのメソッドは、プロテオステイシス ネットワークのコンポーネント調整不溶性タンパク質を決定するための強力なツールをする必要があります。いくつかの介入など減少インスリン/インスリン様成長因子 (IGF) 1 シグナル (IIS)線虫の加齢14を劇的に遅らせることが示されています。長寿経路はしばしばタンパク質品質管理機構を誘導し、こうしてこれらの経路が積極的に影響を与えられます蛋白質の集合の率。たとえば、IIS 経路7の阻害に寿命の長い動物で減らされた内在タンパク質凝集を示す.
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで報告受ける RNAi 解析質量分析法および西部にしみが付くことによって線虫の老化から高い不溶性タンパク質凝集体を分離する手法を提案する.私達は、年齢依存した蛋白質の集合を防止する IIS を大幅に減らすことによってプロテオステイシスを向上させることを示します。線虫c.エレガンス ノザン特定の集計しやすいタンパク質を選択すると、さらに固有の蛋白質凝集を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DZNE とマリー ・ キュリー国際社会復帰グラント (D.C.D.、322120) からの資金によって支えられました。
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
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