מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula
Summary
פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.
Abstract
מוטציות הן כרב משאבים גנטי ללימודי תפקוד הגן. כדי ליצור אוספים מוטציה, שלושה סוגי מוטגנים יכול להיות מנוצל, כולל ביולוגית כגון T-DNA או transposon, כימיקלים כגון אתיל methanesulfonate (EMS), או גופני כגון קרינה יינון. הסוג של מוטציה נצפתה משתנה בהתאם מוטגן בשימוש. למוטנטים הקרינה הנוצרות על ידי יינון, מוטציות כוללות מחיקה, שכפול או סידורם מחדש. בזמן T-DNA או מבוססי transposon מוטגנזה מכוונת מוגבלת מינים רגישים טרנספורמציה, ניתן ליישם מוטגנזה מכוונת כימיים או פיזיים מגוון רחב של מינים. עם זאת, אפיון מוטציות נגזר כימיים או פיזיים מוטגנזה מכוונת באופן מסורתי מסתמך על מבוסס מפה שיבוט בגישה, אשר עבודה אינטנסיבית וצורכת זמן. . הנה, אנחנו מראים כי פלטפורמה מבוססת על מערך השוואתי גנומית הכלאה (aCGH) הגנום בצפיפות גבוהה ניתן ליישם ביעילות לזהות ולאפיין עותק מספר וריאציות (CNVs) של מוטציות נגזר מוטגנזה מכוונת הפגזה (FNB) נייטרון מהיר ב אספסת truncatula, זן קטניות. ניתוח רצף הגנום כולו מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים או דגמים ג’ין truncatula מ’. בבית הנוכחי, הנוצרות על-ידי FNB מוטציות במ truncatula נגזרים מתוך יותר מ-150,000 שורות M1, המייצג משאבים גנטי לא בפז עבור מחקרים פונקציונלי של גנים בגנום. פלטפורמת aCGH המתוארים כאן הוא כלי יעיל עבור אפיון FNB-induced מוטציות ב- truncatula מ’.
Introduction
קטניות (קטניות) הם משפחת השלישית בגודלה של צמחים בעלי פרחים, עם מינים רבים כלכלית כגון סויה (מקס גליצין), אספסת (סאטיבה אספסת). קטניות צמחים יכולים לקיים אינטראקציה עם חנקן-תיקון בחיידקים בקרקעות, בדרך כלל בשם Rhizobia לפתח פקעיות בו dinitrogen עם אווירה תקטן אמוניה לשימוש על ידי המפעל המארח. ככזה, טיפוח של גידולי קטניות דורש קלט הקטן של דשנים חנקן, ובכך תורמת חקלאות בת-קיימא. גידולי קטניות לייצר עלים וזרעים עם תוכן חלבון גבוהה, הגשה מצויינת מספוא וגרעינים. עם זאת, מינים קטניות מעובדים בדרך כלל יש מבנים מורכבים הגנום, ביצוע מחקרים פונקציונלי של גנים לשחק בתפקידי מפתח בתהליכים ספציפיים קטניות, מסורבלת. אספסת truncatula אומצה באופן נרחב כמין דגם ללימודי קטניות בעיקר בגלל זה (1) יש גנום דיפלואידי עם גודל הגנום הפלואידי קטן יחסית (~ 550 Mbp); (2) צמחים יכול להיהפך stably ללימודי פונקציונלי ג’ין; (3) זה קשורה קשר הדוק אספסת (סאטיבה מ’), המלכה מספוא, רבים כלכלית הגידולים החקלאיים ללימודי translational. לאחרונה, רצף הגנום של truncatula מ’ cv Jemalong A17 כבר שוחרר1,2. ביאור של הגנום מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים החזוי או מודלים גנים בגנום. כדי לקבוע את הפונקציה של רוב בגנים truncatula מ’ הגנום הוא משימה מאתגרת. כדי להקל על מחקרים פונקציונלי של גנים, אוסף מקיף של מוטציות בטווח של קווים1 מ’ מעל 150,000 נוצרה באמצעות מוטגנזה מכוונת נייטרון מהיר הפגזה (FNB) ב- truncatula מ’ cv Jemalong A173 ,4. נייטרון מהיר, מוטגן יינון אנרגיה גבוהה, שימש ליצירת מוטציות במינים רבים של צמחים, כולל תודרנית5,6, אורז (אורז sativa)7, עגבניות (סולנום lycopersicum), סויה (גליצין soja; ג’י מקס)8,9, (שעורה מצויה) שעורה ג’אפוניכאס לוטוס10. חלק גדול של מוטציות נגזר FNB מוטגנזה מכוונת הן בשל מחיקות הדנ א הזה מגוון גדול של כמה זוגות בסיס מגה בסיסי זוגות9,11. גנים הקשורים פנוטיפ רבים כבר בהצלחה מזוהה, מאופיין4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. בעבר, שיבוט מולקולרי של גנים הבסיסית של מוטציות FNB הסתמכה על גישה המבוססת על המפה, זמן רב ואינה מגבילה את מספר מוטציות כדי להיות מאופיין ברמה המולקולרית. לאחרונה, מספר גישות ללא תשלום כולל שיטות מבוססות על התעתיק, הגנום ריצוף מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) עבור זיהוי וריאציה מספר עותק ה-DNA ואת רצף הגנום כולו, יש כבר מועסקים כדי להקל אפיון של מחיקה מוטציות אורגניזמים מגוונים כולל בעלי חיים וצמחים20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
כדי להקל על אפיון FNB מוטציות ב- מ truncatula, הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) פלטפורמה פותחה, לאמת. כפי שדווח במערכות בעלי חיים, פלטפורמת CGH מבוסס על מערך מאפשרת גילוי של עותק מספר וריאציות (CNVs) ברמת הגנום כולו ב- FNB מ truncatula מוטציות. יתר על כן, נגעים יכול להיות מאושרות על ידי ה-PCR, מחיקת גבולות יכול להיות מזוהה על ידי רצף. בסך הכל, פלטפורמת array CGH הוא כלי יעיל ואפקטיבי בזיהוי נגעים ב truncatula מ FNB מוטציות. כאן, מומחשים array CGH הליך ואפיון PCR של מחיקת גבולות במוטציה FNB truncatula מ’ .
להלן כללי התנהגות מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) ניתוח של מספר עותק וריאציות בצמחים. לדוגמה, אספסת truncatula FN6191 מוטציה שימש כדי לזהות אזורים המחיקה ואת המועמד גנים הקשורים פנוטיפים מוטציה. מוטציה FN6191 מ truncatula , במקור מבודד של אוסף מוטציה מחיקה הנוצרות על-ידי הפגזה נייטרון מהיר32 (ראה טבלה של חומרים), הציג הפנוטיפ היפר-nodulation לאחר חיסון עם האדמה חיידק, Sm1021 Sihorhizobium meliloti , בניגוד פראי סוג צמחים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו פלטפורמה CGH מבוסס על מערך זיהוי, אפיון נייטרון מהיר הפגזה (FNB)-induced מוטציות ב truncatula מ cv. Jemalong A17. כדי להדגים את השימוש במערך CGH שיטת באיתור מוטציות, ביצענו ניתוח aCGH של המוטציה FN6191, אשר הציג הפנוטיפ היפר-nodulation בניגוד פראי סוג צמחים, כאשר מחוסן עם meliloti ס Sm1021. לניתוח פילוח, קטע הייתה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון של עבודה זו מסופק בחלקו על ידי מענק של מחקר הגנום של הצמח NSF (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
References
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
