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Genetics

तेज़ न्यूट्रॉन-प्रेरित मेडिकागो truncatula म्यूटेंट में प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों के कुशल डिटेक्शन के लिए एक सरणी-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण प्लेटफ़ॉर्म

Published: November 08, 2017
doi:
10.3791/56470
, , , , ,
1Laboratory of Plant Genetics and Development,Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory,University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School,Li Shui University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रायोगिक कदम और रिएजेंट, उपकरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और विश्लेषण उपकरण शोधकर्ताओं जो बाहर ले जाने में रुचि रखते है के लिए पूरी जीनोम ऐरे-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) विश्लेषण में प्रतिलिपि संख्या में भिंनता पौधे.

Abstract

म्यूटेंट जीन फंक्शन स्टडीज के लिए अमूल्य आनुवंशिक संसाधन हैं. उत्परिवर्ती संग्रह उत्पन्न करने के लिए, तीन प्रकार के mutagens का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें जैविक जैसे टी-डीएनए या transposon, केमिकल जैसे एथिल methanesulfonate (ईएमएस), या ionization विकिरण जैसे भौतिक शामिल हैं । उत्परिवर्तन के प्रकार मनाया mutagen इस्तेमाल के आधार पर बदलता रहता है । ionization विकिरण प्रेरित म्यूटेंट के लिए, उत्परिवर्तनों विलोपन, दोहराव, या पुनर्व्यवस्था शामिल हैं । जबकि T-डीएनए या transposon आधारित mutagenesis प्रजातियों कि परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं करने के लिए सीमित है, रासायनिक या भौतिक mutagenesis प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, रासायनिक या शारीरिक mutagenesis से व्युत्पंन उत्परिवर्तनों के लक्षण पारंपरिक रूप से एक नक्शा आधारित क्लोनिंग दृष्टिकोण है, जो श्रम गहन और समय लेने पर निर्भर करता है । यहां, हम बताते है कि एक उच्च घनत्व जीनोम सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (aCGH) मंच पर लागू किया जा सकता है कुशलता से पता लगाने और प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों (CNVs) में तेजी से न्यूट्रॉन बमबारी (म्यूटेंट) एफएनबी से व्युत्पंन mutagenesis में की विशेषता मेडिकागो truncatula, एक फली प्रजाति । पूरे जीनोम अनुक्रम विश्लेषण से पता चलता है कि एम. truncatulaमें ५०,००० से अधिक जीन या जीन मॉडल हैं । वर्तमान में, एम. truncatula में एफएनबी-प्रेरित म्यूटेंट १५०,००० M1 से अधिक लाइनों से व्युत्पंन हैं, जीनोम में जीन के कार्यात्मक अध्ययन के लिए अमूल्य आनुवंशिक संसाधनों का प्रतिनिधित्व । aCGH मंच यहां वर्णित है निस्र्पक एफएनबी में प्रेरित म्यूटेंट के लिए एक कुशल उपकरण है एम. truncatula।

Introduction

फलियां (फैबेसी) फूलों के पौधों का तीसरा सबसे बड़ा परिवार हैं, जैसे सोयाबीन (Glycine max) और अल्फला (मेडिकागो sativa) के रूप में कई आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के साथ । फली पौधों नाइट्रोजन के साथ बातचीत कर सकते है मिट्टी के बैक्टीरिया फिक्सिंग, आम तौर पर कहा जाता है कि जड़ पिंड जिसमें वायुमंडलीय dinitrogen मेजबान संयंत्र द्वारा उपयोग के लिए अमोनिया के लिए कम है विकसित करने के लिए Rhizobia । जैसे, फली फसलों की खेती नाइट्रोजन उर्वरकों के थोड़ा इनपुट की आवश्यकता है और इस तरह टिकाऊ कृषि के लिए योगदान देता है । फली फसलें उच्च प्रोटीन सामग्री के साथ पत्तियों और बीजों का उत्पादन, उत्कृष्ट चारा और अनाज फसलों के रूप में सेवारत । हालांकि, खेती फली प्रजातियों आम तौर पर जटिल जीनोम संरचनाओं है, जीन है कि फली-विशिष्ट प्रक्रियाओं बोझिल में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के कार्यात्मक अध्ययन कर रही है । मेडिकागो truncatula व्यापक रूप से फली अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रजातियों के रूप में अपनाया गया है मुख्यतः क्योंकि (1) यह एक अपेक्षाकृत छोटे अगुणित जीनोम आकार (~ ५५० Mbp) के साथ एक द्विगुणित जीनोम है; (२) पौधों को छुरा जीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए रूपांतरित किया जा सकता है; और (3) यह बारीकी से अल्फला (एम. sativa), चारा की रानी, और कई अंय अनुवाद अध्ययन के लिए आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों से संबंधित है । हाल ही में, एम truncatula सीवी Jemalong A17 के जीनोम अनुक्रम1,2जारी किया गया है । जीनोम के एनोटेशन से पता चलता है कि वहां से अधिक ५०,००० की भविष्यवाणी की जीन या जीनोम में जीन मॉडल हैं । एम. truncatula जीनोम में अधिकांश जीनों का कार्य निर्धारित करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है. जीन के कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा के लिए, १५०,००० मीटर से अधिक1 लाइनों की सीमा में म्यूटेंट का एक व्यापक संग्रह एम truncatula में तेजी से न्यूट्रॉन बमबारी (एफएनबी) mutagenesis का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है ,4. तेज न्यूट्रॉन, एक उच्च ऊर्जा ionization mutagen, म्यूटेंट पैदा करने में प्रयोग किया गया है जिनमें कई पादप प्रजातियों में Arabidopsis5,6, चावल (धान्य sativa)7, टमाटर (मकोय lycopersicum), सोयाबीन (Glycine सोज़; G. max)8,9, जौ (Hordeum अश्लीलता), और लोटस japonicus10. एफएनबी mutagenesis से व्युत्पंन परिवर्तन का एक बड़ा हिस्सा डीएनए विलोपन कि कुछ आधार जोड़े से आकार में मेगा आधार जोड़े9,11के लिए सीमा के कारण हैं । कई phenotype-जुड़े जीनों को सफलतापूर्वक पहचाना गया है और4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. पहले, एफएनबी म्यूटेंट से अंतर्निहित जीन के आणविक क्लोनिंग एक नक्शे पर भरोसा आधारित दृष्टिकोण है, जो समय लगता है और म्यूटेंट की संख्या सीमा को आणविक स्तर पर विशेषता है । हाल ही में, प्रतिलिपि सहित कई मानार्थ दृष्टिकोण आधारित तरीकों, जीनोम छत सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) डीएनए की प्रतिलिपि संख्या भिन्नता का पता लगाने के लिए, और पूरे जीनोम अनुक्रमण, की सुविधा के लिए नियोजित किया गया है पशुओं और पौधों सहित विविध जीवों में विलोपन म्यूटेंट का लक्षण वर्णन20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

एम. truncatulaमें एफएनबी म्यूटेंट के लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए, एक पूरे जीनोम सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) मंच विकसित और मांय किया गया है । के रूप में पशु प्रणालियों में बताया, सरणी आधारित CGH मंच की नकल की खोज की अनुमति देता है संख्या रूपांतरों (CNVs) में पूरे जीनोम के स्तर पर एम. truncatula एफएनबी म्यूटेंट । इसके अलावा, घावों पीसीआर द्वारा पुष्टि की जा सकती है और विलोपन सीमाओं अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है । कुल मिलाकर, सरणी CGH मंच एम. truncatula एफएनबी म्यूटेंट में घावों की पहचान करने में एक कुशल और प्रभावी उपकरण है । यहां, सरणी CGH प्रक्रिया और एक एम. truncatula एफएनबी उत्परिवर्ती में हटाने की सीमाओं की पीसीआर लक्षण सचित्र हैं ।

निंनलिखित प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक कदम और रिएजेंट के बारे में जानकारी प्रदान करता है, उपकरणों और विश्लेषण उपकरण शोधकर्ताओं जो बाहर ले जाने में रुचि रखते है के लिए पूरी जीनोम ऐरे-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) प्रतिलिपि संख्या का विश्लेषण पौधों में भिन्नता । एक उदाहरण के रूप में, मेडिकागो truncatula FN6191 उत्परिवर्ती विलोपन क्षेत्रों और उंमीदवार उत्परिवर्ती phenotypes के साथ जुड़े जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एम. truncatula FN6191 उत्परिवर्ती, मूल रूप से एक तेज न्यूट्रॉन बमबारी से पृथक-प्रेरित विलोपन उत्परिवर्ती संग्रह३२ ( सामग्री की तालिकादेखें), मिट्टी के साथ टीका के बाद एक हाइपर-nodulation phenotype का प्रदर्शन जीवाणु, Sihorhizobium meliloti Sm1021, जंगली प्रकार के पौधों के विपरीत ।

Protocol

नोट: चित्रा 1 सरणी CGH प्रोटोकॉल के लिए पांच चरणों का पता चलता है. वे हैं: 1) संयंत्र सामग्री की तैयारी; 2) उच्च गुणवत्ता डीएनए नमूनों की अलगाव; 3) लेबलिंग और डीएनए नमूनों की शुद्धि; 4) संकरण, धु?…

Representative Results

चित्रा 2 पूरे जीनोम भर में WT सिग्नल के उत्परिवर्ती बनाम सामान्यीकृत लॉग2 अनुपात के वितरण से पता चलता है । CGH डेटा का विश्लेषण 4 गुणसूत्र है कि पूरे SUNN जीन३३ और FN6191 उत्?…

Discussion

हम एक सरणी आधारित CGH मंच का पता लगाने और तेज न्यूट्रॉन बमबारी (एफएनबी) के लक्षण वर्णन के लिए विकसित किया है-प्रेरित म्यूटेंट M. truncatula cv. Jemalong A17 में । जीन उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सरणी CGH विधि के उपयोग को…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम के वित्तपोषण NSF संयंत्र जीनोम अनुसंधान (IOS-११२७१५५) से एक अनुदान द्वारा भाग में प्रदान की जाती है ।

Materials

Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9
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References

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Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).
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