JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad Medicago truncatula mutanter

Published: November 08, 2017
doi:
10.3791/56470
, , , , ,
1Laboratory of Plant Genetics and Development,Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory,University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School,Li Shui University

Summary

Det här protokollet ger experimentella anvisningar och information om reagenser, utrustning och analysverktyg för forskare som är intresserade av att genomföra hela genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) analys av kopia antalet variationer i växter.

Abstract

Mutanter är ovärderlig genetiska resurser för gen funktion studier. För att generera mutant samlingar, kan tre typer av mutagena ämnen utnyttjas, inklusive biologiska såsom T-DNA eller transposon, kemiska såsom etyl methanesulfonate (EMS) eller fysiska såsom jonisering strålning. Vilken typ av mutation observerade varierar beroende på den mutagen som används. För jonisering strålning inducerade mutanter inkluderar mutationer borttagning, dubbelarbete eller omflyttning. Även T-DNA eller transposon-baserat mutagenes är begränsad till arter som är mottagliga för omvandling, kan kemiska eller fysiska mutagenes tillämpas på ett brett spektrum av arter. Karakterisering av mutationer som härrör från kemisk eller fysikalisk mutagenes traditionellt är dock beroende av ett kartbaserat kloning tillvägagångssätt, som är labor intensiv och tidskrävande. Här, visar vi att en hög densitet genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (aCGH) plattform kan tillämpas för att effektivt upptäcka och karaktärisera kopia antalet variationer (CNVs) i mutanter som härrör från snabb neutron beskjutning (FNB) mutagenes i Medicago truncatula, släktet baljväxter. Hela genomet sekvens analysen visar att det finns fler än 50 000 gener eller gen modeller i M. truncatula. På nuvarande, FNB-inducerade mutanter i M. truncatula härrör från mer än 150 000 M1 linjer, som representerar ovärderliga genetiska resurser för funktionella studier av gener i genomet. ACGH plattformen beskrivs här är ett effektivt verktyg för att karaktärisera FNB-inducerade mutanter i M. truncatula.

Introduction

Ärtväxter (Fabaceae) är den tredje största familjen av blommande växter, med många ekonomiskt viktiga arter såsom sojabönor (Glycine max) och alfalfa (Medicago sativa). Baljväxt växter kan interagera med kvävefixerande jordbakterier, allmänt kallad Rhizobia att utveckla roten knölar där den atmosfäriska Kvävetetroxid minskas till ammoniak för användning av värdväxt. Som sådan, odling av baljväxter kräver liten insats av kväve gödselmedel och således bidrar till hållbart jordbruk. Baljväxter ger bladen och fröna med hög proteinhalt, som serverar utmärkt foder och spannmålsskörden. Odlade baljväxter arter har dock generellt komplexa genomet strukturer, att göra funktionella studier av gener som spelar viktiga roller i baljväxter-specifika processer omständligt. Medicago truncatula har allmänt antagits som en modell art för baljväxter studier främst eftersom (1) den har en diploida genomet med en relativt liten haploida genomet storlek (~ 550 Mbp); (2) växter omvandlas stabilt för genen funktionella studier; och (3) det är närbesläktat med alfalfa (M. sativa), drottningen av Vallfoder och många andra ekonomiskt viktiga grödor för translationella studier. Nyligen, genomsekvens av M. truncatula cv Jemalong A17 har släppt1,2. Annotering av genomet visar att det finns mer än 50.000 förutspådda gener eller gen modeller i genomet. För att avgöra funktionen av de flesta av generna i den M. truncatula är genomet en utmanande uppgift. För att underlätta funktionella studier av gener, en omfattande samling av mutanter i spänna av över 150 000 M1 rader har genererats med hjälp av snabb neutron beskjutning (FNB) mutagenes i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Snabb neutron, hög energi jonisering mutagen, har använts i generera mutanter i många växtarter inklusive Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), sojabönor (Glycine soja; G. max)8,9, korn (Hordeum vulgare) och Lotus japonicus10. En stor del av mutationer som härrör från FNB mutagenes beror på DNA borttagningar som varierar i storlek från några baspar till mega baspar9,11. Många fenotyp-associerade gener har varit framgångsrikt identifieras och karakteriseras4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidigare, molekylär kloning av underliggande generna från FNB mutanter åberopade ett kartbaserat tillvägagångssätt som är tidskrävande och begränsar antalet mutanter att präglas på molekylär nivå. Nyligen, flera gratis metoder inklusive avskrift-baserade metoder, genomet plattsättning arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) för DNA kopia nummer variant upptäckt, och hela Genomsekvensering, har anställts för att underlätta den karakterisering av radering mutanter i olika organismer inklusive djur och växter20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

För att underlätta karakterisering av FNB mutanter i M. truncatula, en helgenom-arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) har plattformen utvecklats och validerats. Som rapporterats i djurens system, kan arraybaserade CGH plattformen kopiera antal variationer (CNVs) på hela genomet nivå i M. truncatula FNB mutanter. Dessutom lesioner kan bekräftas genom PCR och radering gränser kan identifieras genom sekvensering. Övergripande, den array-CGH plattformen är ett effektivt verktyg att identifiera lesioner i M. truncatula FNB mutanter. Här, illustreras i förfarandet för array-CGH och PCR-karakterisering av radering gränser i en M. truncatula FNB mutant.

Följande protokoll ger experimentella anvisningar och information om reagenser, utrustning och analysverktyg för forskare som är intresserade av att genomföra hela genomet arraybaserade jämförande genomisk hybridisering (CGH) analys av kopia antal variationer i växter. Som ett exempel, var Medicago truncatula FN6191 mutant används för att identifiera radering regioner och kandidatgener associerade med muterade fenotyper. M. truncatula FN6191 mutant, ursprungligen isolerats från en snabb neutron beskjutning-inducerad radering mutant samling32 (se Tabell för material), uppvisade en hyper-nodulationen fenotyp efter inokulering med marken bakterie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i motsats till vildtyp växter.

Protocol

Obs: figur 1 visar de fem stegen för matrisen CGH protokoll. De är: 1) beredning av växtmaterial; (2) isolering av hög kvalitet DNA-prover; (3) märkning och rening av DNA-prover; (4) hybridisering, tvätt och scanning av hela genomet arrayer; och 5) CGH dataanalys. M. truncatula hela genomet plattsättning arrayer innehåller sammanlagt 971,041 unika oligo-prober som riktar sig till mer än 50 000 gener eller gen modeller i genomet (se tabell material). De un…

Representative Results

Figur 2 visar fördelningen av normaliserade log2 nyckeltal av muterade kontra WT signaler över hela genomet. Analysen av CGH data visade en ungefärlig 22 kb borttagning på kromosom 4 som omfattar den hela SUNN gen33 och flera andra kommenterade gener i FN6191 mutant (figur 2, figur 3). Regionen kandidat borttagna täcktes av 73 i följd sonder på matri…

Discussion

Vi har utvecklat en matris-baserad CGH plattform för upptäckt och karakterisering av snabb neutron beskjutning (FNB)-inducerade mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. För att demonstrera användningen av matrisen CGH metod att upptäcka genmutationer, utfört vi aCGH analys av muterat FN6191, som ställde ut en hyper-nodulationen fenotyp i motsats till vildtyp växter, när inokuleras med S. meliloti Sm1021. För segmentering analys ansågs ett segment betydande om förhållandet log2 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansieras delvis genom ett bidrag från NSF växtforskning genomet (IOS-1127155).

Materials

Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

Tags

Array-based Comparative Genomic HybridizationCopy Number VariationsFast Neutron-induced MutantsMedicago TruncatulaLegume BiologyNodule DevelopmentDNA ExtractionDNA LabelingDNA Purification
check_url/56470?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image