Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный в Vivo модель для изучения хост микробных взаимодействий
Summary
Здесь мы представляем нематоды Caenorhabditis elegans как универсальный хост модель для изучения взаимодействия микроорганизмов.
Abstract
Мы демонстрируем метода с помощью Caenorhabditis elegans как модель для изучения взаимодействия микроорганизмов. Микробы вводятся через диетические, делая основное расположение для заболеваний ЖКТ. Нематоды intestine структурно и функционально имитирует млекопитающих кишечника и прозрачна, что делает поддаются микроскопическое исследование колонизации. Здесь мы покажем, что патогенные микроорганизмы могут вызвать болезни и смерти. Мы в состоянии определить микробных мутантов, которые показывают изменения вирулентности. Ее сохраняется врожденный ответ биотических стрессов делает C. elegans отличной системой зонда грани принимающей innate иммунных взаимодействий. Мы показывают, что хосты с мутациями в гене двойной оксидазы нельзя производить реактивнооксигенных видов и не могут противостоять микробов оскорбление. Мы далее продемонстрировать универсальность представленных выживания assay, показывая, что он может использоваться для изучения последствий ингибиторы роста микроорганизмов. Этот assay может также использоваться для обнаружения Факторы вирулентности грибковых как цели в области развития новых противогрибковых агентов, а также обеспечить возможность для дальнейшего выявления хост микробных взаимодействий. Дизайн этот assay хорошо поддается высокой пропускной способности всего генома экранов, в то время как способность червей крио сохранить для будущего использования делает его экономически эффективным и привлекательным целом животных модель для изучения.
Introduction
C. elegans был использован как организм мощные модели для более чем 50 лет. В 1960 году Южной Африки биолог Сидней Бреннер пионером в использовании C. elegans для изучения развития нервной системы, проложив путь для длинные линии ученых для изучения различных аспектов биологии клетки и животных в нематод. Эта линия включает в себя лауреатов Нобелевской премии, Крейг Мелло и Эндрю огонь для работы их RNAi1, Роберт Horvitz Салстон, Джон за их работу по развитию орган и апоптоз2,3,4и Мартин Чалфи для его работы на Зеленый флуоресцирующий белок5. Хотя эта модель организма традиционно использовались для изучения молекулярных и развития биологии, за последние 15 лет, исследователи начали использовать C. elegans для изучения биологии различных патогенов человека, включая Pseudomonas aeruginosa, золотистый стафилококк, Salmonella entericaи Serratia marcescens6,,78,9,10. Эти исследования показали, что многие механизмы, участвующие во взаимодействии человека возбудитель сохраняются в нематод, но и что существуют некоторые механизмы иммунитета, которые являются уникальными для этой модели организма11,12. В природе C. elegans встречает различных угроз от попадает патогенных микроорганизмов, присутствующих в почве, и это оказывает сильное селективного давления развиваться и поддерживать сложные врожденной иммунной системы в его просвете кишечника. Многие из генов и механизмов в деле защиты кишечника люмен организовали хорошо сохранились элементы, которые также существуют в высших млекопитающих11,13. C. elegans поэтому представляет большой модели для изучения желудочно-кишечных патогенов как Salmonella enterica14, Shigella boydii15или16 вибрион холеры.
Здесь мы подчеркиваем замечательный универсальность C. elegans как хозяин модель для изучения инфекционных агентов, таких как C. albicans. C. elegans как модель хост позволяет для высокой пропускной способности скрининга для вирулентности, что является менее дорогостоящим и трудоемким, чем модель мыши, которой обычно используется для изучения кандидоз42.
В этом исследовании мы показываем, что эта модель и подсказать выживания assay может использоваться надежно для изучает принимающей врожденной иммунной эффекторов важно противодействовать инфекций, возбудителя определяющих факторов вирулентности, диск и фармакологические соединений, которые могут вмешиваться в патогенезе. Отличается от ранее описанных анализов, этот метод обеспечивает средства изучения воздействия возбудителя в течение животного, от личиночной стадии взрослой жизни, а не только взрослой жизни до смерти43,44. В целом, наши C. elegans – C. albicans модель является универсальный и мощный инструмент, который может использоваться не только для изучения генетических основ, которые управляют инфекция и иммунитет, но и для выявления новых соединений для терапевтического вмешательства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы для assaying C. elegans инфекции и выживания за время жизни воздействия C. albicans , который мы описали могут быть изменены для проверки другой патогена. Жидкий культур другой бактерий или грибов могут сделаны и кормили в C. elegans в подобной манере. Кроме того, может быть assayed после…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена на и поддерживаемых Вустер политехнического института.
Materials
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
- Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
- Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
- Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
- Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
- Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
- Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
- Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
- Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
- Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
- Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
- Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
- Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
- Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
- McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
- Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
- Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
- Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
- Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
- Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
- Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
- Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
- Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
- Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
- Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
