ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف
Summary
نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.
Abstract
علينا أن نظهر أسلوب استخدام ايليجانس كاينورهابديتيس كمضيف نموذج لدراسة التفاعل الميكروبية. ويتم إدخال الميكروبات عن طريق النظام الغذائي يجعل الأمعاء الموقع الرئيسي للمرض. الأمعاء السلكية هيكلياً ووظيفيا يقلد أمعاء الثدييات وهو شفاف يجعلها قابلة للدراسة المجهرية للاستعمار. هنا نظهر أن مسببات الأمراض يمكن أن تسبب المرض والموت. نحن قادرون على تحديد طفرات الميكروبية التي تظهر ضراوة غيرت. يجعل استجابتها الفطرية المصانة الإجهادات الأحيائية C. ايليجانس نظاما ممتازا للتحقيق في أوجه التفاعلات المناعية الفطرية المضيف. نظهر أن تستضيف مع الطفرات في الجين أوكسيديز المزدوج لا يمكن أن تنتج الأنواع الأكسجين التفاعلية وغير قادر على مقاومة الميكروبات إهانة. كذلك ندلل على براعة المقايسة بقاء قدم بإظهار أنه يمكن استخدامه لدراسة تأثيرات مثبطات لنمو الميكروبات. كما يمكن استخدام هذا الفحص اكتشاف عوامل الفوعة الفطرية كأهداف لتطوير العوامل المضادة للفطور الرواية، فضلا عن إتاحة فرصة لمواصلة الكشف عن التفاعلات بين الميكروبات والمضيف. تصميم هذا التحليل يفسح المجال أيضا لإنتاجية عالية شاشات كل الجينوم، بينما القدرة على الديدان cryo-المحافظة لاستخدامها في المستقبل يجعل من نموذج حيوان كله جذابة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة.
Introduction
C. ايليجانس قد استخدمت ككائن نموذج قوية لأكثر من 50 عاماً. وفي الستينات، رائدة الأحياء جنوب أفريقيا سيدني برينر استخدام C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا العصبية، يمهد الطريق لنسب طويلة من العلماء لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلية والحيوان في الديدان الخيطية. وتشمل هذه النسب الحائزين على جائزة نوبل كريغ ميلو وأندرو النار على العمل [رني]1وروبرت هورفيتز وجون سالستون للعمل على تطوير الجهاز والمبرمج2،،من34، ومارتن تشالفي لعمله على بروتين فلوري أخضر5. على الرغم من أن هذا الكائن الحي النموذجي قد استخدمت تقليديا لدراسة البيولوجيا الجزيئية والإنمائية، على مدى السنوات ال 15 الماضية، بدأ الباحثون استخدام C. ايليجانس للتحقيق بيولوجيا مختلف مسببات الأمراض البشرية بما في ذلك Pseudomonas الزّنجاريّة، انتيريكا السالمونيلا، المكوّرات العنقودية الذهبيةو marcescens السراتية6،،من78،9،10. وكشفت هذه الدراسات أن العديد من الآليات التي تشارك في التفاعل الإنسان-الممرض هي المحافظة في الديدان الخيطية، ولكن أيضا أن هناك بعض آليات الحصانة التي فريدة من نوعها لهذا النموذج الحي11،12. في الطبيعة، C. ايليجانس لقاءات مجموعة متنوعة من التهديدات من مسببات الأمراض المستهلكة الموجودة في التربة، ووفر هذا ضغط انتقائي قوية في التطور والحفاظ على نظام المناعة فطرية متطورة في التجويف المعوي،. العديد من الجينات والآليات التي تشارك في حماية التجويف المعوي هي مدبرة من قبل العناصر المحافظة جداً التي توجد أيضا في11،الثدييات العليا13. ولذلك يمثل C. ايليجانس نموذج عظيم لدراسة مسببات الأمراض المعدية المعوية مثل السالمونيلا انتيريكا14أو15من بويديي دوسنتاريا ضمه الكوليرا16.
هنا نسلط الضوء على براعة ملحوظة في C. ايليجانس كمضيف نموذج لدراسة العوامل المعدية مثل المبيضة. C. ايليجانس كمضيف نموذج يسمح لفحص إنتاجية عالية لضراوة التي أقل تكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً من نموذج الفأر، الذي يستخدم عادة لدراسة داء المبيضات42.
في هذه الدراسة، تبين لنا أن هذا النموذج ومقايسة البقاء على قيد الحياة أسوسياتيد يمكن موثوق بها لدراسة المضيف المستجيبة المناعة الفطرية الهامة لمكافحة العدوى، والمحددات الخاصة بالعوامل الممرضة التي تدفع بضراوة، والمركبات الدوائية التي يمكن أن أن تتدخل في نشوء المرض. تختلف عن الاختبارات الموصوفة سابقا، هذا الأسلوب يوفر وسيلة لدراسة التعرض للعوامل الممرضة على مدى فترة عمر الحيوان، من مرحلة اليرقات إلى مرحلة البلوغ، بدلاً من فقط سن البلوغ إلى وفاة43،44. وباختصار، لدينا C. ايليجانس -نموذج المبيضة هو أداة قوية وتنوعاً التي يمكن استخدامها ليس فقط لدراسة الأسس الوراثية التي تقود العدوى والحصانة ولكن أيضا لتحديد مركبات جديدة للتدخل العلاجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تعديل طرق المعايرة C. ايليجانس العدوى والبقاء على قيد الحياة على مدى التعرض مدى الحياة المبيضة التي وصفناها لاختبار آخر الممرض. قد السائل ثقافات أخرى من البكتيريا أو الفطريات وتتغذى على C. ايليجانس بطريقة مماثلة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون جزيئي التهابات المسلسل بتعريض ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل المنجز في ويدعمها معهد البوليتكنيك ورسيستر.
Materials
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
- Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
- Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
- Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
- Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
- Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
- Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
- Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
- Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
- Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
- Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
- Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
- Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
- Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
- McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
- Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
- Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
- Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
- Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
- Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
- Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
- Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
- Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
- Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
- Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
