Den nematoder Caenorhabditis Elegans - en mångsidig In Vivo -modell för att studera värd-mikrobinteraktioner
Summary
Här presenterar vi Nematoden Caenorhabditis elegans som en mångsidig värdemodell för att studera mikrobiell interaktion.
Abstract
Vi visar en metod där Caenorhabditis elegans som en modell värd för att studera mikrobiell interaktion. Mikrober införs via kosten att göra tarmen den primära platsen för sjukdom. Nematoder tarmen strukturellt och funktionellt härmar däggdjur tarmar och är transparent vilket gör den mottaglig för mikroskopisk undersökning av colonization. Här visar vi att patogener kan orsaka sjukdom och död. Vi har möjlighet att identifiera mikrobiell mutanter som visar förändrad virulens. Dess bevarade medfödda svar för biotiska påfrestningar gör C. elegans ett utmärkt system sond aspekter av värd medfödd immun-interaktioner. Vi visar att värdar med mutationer i genen dubbla oxidas inte kan producera reaktiva syreradikaler och inte kan motstå mikrobiell förolämpning. Vi ytterligare Visa mångsidigheten hos presenterade överlevnad analysen av visar att det kan användas för att studera effekterna av hämmare av mikrobiell tillväxt. Denna analys kan också användas för att upptäcka svamp virulensfaktorer som mål för utvecklingen av romanen antimykotika, samt ge möjlighet till ytterligare avslöja värd-mikrobinteraktioner. Utformningen av denna analys lämpar sig väl för hög genomströmning helgenom-skärmar, medan förmågan att cryo-preserve maskar för framtida användning gör det en kostnadseffektiv och attraktiva hela djurmodell att studera.
Introduction
C. elegans har använts som en kraftfull modellorganism för mer än 50 år. I 1960 pionjärer sydafrikanska biolog Sydney Brenner användningen av C. elegans att studera neuronal utveckling, banar väg för en lång härstamning av forskare att studera olika aspekter av cellen och djurens biologi i nematoder. Denna härstamning innehåller nobelpristagare Craig Mello och Andrew Fire för deras RNAi arbete1, Robert Horvitz och John Sulston för deras arbete på orgel utveckling och apoptos2,3,4, och Martin Chalfie för hans arbete med grönt fluorescerande protein5. Även om denna modellorganism har traditionellt använts för att studera molekylära och developmental biology, under de senaste 15 åren, har forskarna börjat använda C. elegans att undersöka olika mänskliga patogener inklusive Pseudomonas biologi aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaoch Serratia marcescens6,7,8,9,10. Dessa studier visade att många av mekanismerna som är involverade i mänskliga-patogen samspelet bevaras i nematoder, men också att det finns vissa immunitet mekanismer som är unika för denna modell organism11,12. I naturen, C. elegans möter en mängd hot från intagna patogener närvarande i marken och detta har gett ett starkt selektionstryck att utvecklas och bibehålla en sofistikerad medfödda immunförsvaret i dess intestinala lumen. Många av de gener och mekanismer som är inblandade i skyddet av intestinala lumen är iscensatt av starkt konservativa element som också finns i högre däggdjur11,13. C. elegans utgör därför en bra modell för att studera mag patogener som Salmonella enterica14, Shigella boydii15eller Vibrio kolera16.
Här belyser vi anmärkningsvärd mångsidigheten hos C. elegans som en modell värd att studera smittämnen såsom C. albicans. C. elegans som en modell värd möjliggör hög genomströmning screening för virulens som är mindre dyra och tidskrävande än en musmodell, som vanligtvis används för att studera candidiasis42.
I den här studien visar vi att denna modell och anknutet överlevnad analysen på ett tillförlitligt sätt kan användas för att studera värd medfödd immun effektorer viktigt att motverka infektioner, patogen bestämningsfaktorer som driver virulens, och farmakologiska föreningar som kan ingripa i patogenesen. Olikt tidigare beskrivna analyser, denna metod ger en möjlighet att studera exponering för patogener under hela livstiden för djuret, från larvstadium till vuxen ålder, snarare än bara vuxenlivet till döden43,44. Sammanfattningsvis, vår C. elegans – är C. albicans modellen en mångsidig och kraftfullt verktyg som kan användas inte bara för att studera de genetiska baserna som driver infektion och immunitet utan också att identifiera nya föreningar för terapeutisk intervention.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderna för testmetoder C. elegans infektion och överlevnad över livstidsexponeringen för C. albicans som vi har beskrivit kan ändras för att testa en annan patogen. Flytande kulturer en annan bakterier eller svamp kan göras och matas till C. elegans på ett liknande sätt. Dessutom seriell infektioner kan analyseras genom först utsätta larven till en patogen som beskrivs, och sedan överföra djuren på ny plåt som innehåller en separat patogen efter att ha nått vuxen ålder.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete utfördes på och stöds av Worcester Polytekniska institutet.
Materials
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
- Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
- Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
- Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
- Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
- Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
- Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
- Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
- Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
- Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
- Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
- Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
- Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
- Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
- McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
- Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
- Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
- Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
- Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
- Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
- Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
- Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
- Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
- Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
- Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
