Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven
Summary
Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.
Abstract
Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.
Introduction
Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion3. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion, erfordern oft Mikroinjektion in späteren Embryonen und Larven mit größeren Spurweite Kapillare Nadeln4. Verwendung von größeren g-Nadeln stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen, da es immer schwieriger, das Zielgewebe zu durchdringen, ohne Drücken oder Rollen des Embryos ist. Unter diesen Bedingungen kann Einholung der entsprechenden Wasser Spannung erforderlich, um den Embryo zu stabilisieren, während Trocknung während des Verfahrens zu vermeiden schwierig ist und die Embryonen nicht ideal für die Injektion in das Zielgewebe orientieren.
Nach Mikroinjektion ist es oft sinnvoll, Bildschirm injizierte Embryonen diejenigen auswählen, die erfolgreich injiziert wurde und Bilder von den ersten Zeitpunkt zu erfassen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate entwickelt, die helfen, um 2 Dpf Embryonen in verschiedenen Ausrichtungen Mikroinjektion5, sowohl für schnelle Image-basierten Screening nach der Injektion zu stabilisieren.
Um ausreichende strukturelle Auflösung in diesen Geräten zu erhalten, haben wir photolithographische Techniken verwendet. In mikroelektronischen Industrie und mehr vor kurzem hochgerechnet auf mikrofluidischen Fertigung allgemein verwendet, können diese Ansätze vertikale Strukturen von 1-1.000 µm, einer Skala gut geeignet zur Manipulation von Zebrafisch-Embryonen und Larven bis hin erreichen. Alle Geräte wurden hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die billig, körperlich robust, biologisch inert und transparent ist.
Mikrostrukturierte Oberfläche Arrays (MSAs) wurden als Blöcke von PDMS mit einer gemusterten Oberfläche formatiert, analog zu der einfache Kanäle in Agarose Blöcken gebräuchlich für Ei Mikroinjektion. Nach der Injektion Screening können 6 imaging-Geräte in ein standard Glasboden-6-Well-Platte angeordnet. Diese Geräte eignen sich für einfache Befüllung von Embryonen, während der Entlade Verfahren bequem Rettung von bestimmten Embryonen, Erleichterung ermöglicht Image-basierte screening Ansätze in benutzerfreundlicher Weise als diese Geräte zuvor erarbeiteten die Beebe-Labor-6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion5erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.
Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfäll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte David Langenau danken für die großzügige Bereitstellung von Aquarium Raum; Eric Stone, John C. Moore und Qin Tang für Hilfe bei Zebrafisch Wartung und Reagenzien, und Anne Robertson und Elliott Hagedorn aus Leonard Zon Labor für die Beschaffung der hier verwendeten Zebrafisch-Stamm. Sie möchte auch Octavio Hurtado für Ratschläge, photolithographische Techniken zu danken. FE wurde durch Stipendien aus Shriner es Krankenhaus für Kinder und der amerikanischen Australian Association finanziert. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert GM92804 zu gewähren.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
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