Zebrafish लार्वा के अनुकूलित Microinjection और इमेजिंग के लिए Microstructured उपकरण
Summary
zebrafish भ्रूण और लार्वा की Microinjection एक महत्वपूर्ण लेकिन चुनौतीपूर्ण तकनीक कई zebrafish मॉडलों में इस्तेमाल किया है । यहां, हम अतिसूक्ष्म उपकरण की एक सीमा के स्थिरीकरण और दोनों microinjection और इमेजिंग के लिए zebrafish के उंमुखीकरण में सहायता के लिए मौजूद हैं ।
Abstract
Zebrafish विभिंन मानव रोगों के एक शक्तिशाली मॉडल और प्रयोगात्मक अध्ययन की एक बढ़ती हुई सीमा के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में उभरा है, बड़े पैमाने पर आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन के माध्यम से मौलिक विकास जीव विज्ञान फैले । हालांकि, कई प्रयोगों, विशेष रूप से संक्रमण और xenograft मॉडल से संबंधित उन, microinjection और भ्रूण और लार्वा, जो श्रमसाध्य तकनीक है कि कौशल और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है की इमेजिंग पर भरोसा करते हैं । परिशुद्धता और वर्तमान microinjection तकनीकों का प्रवाह में सुधार करने के लिए, हम microstructured उपकरणों की एक श्रृंखला को विकसित करने के लिए ओरिएंट और 2 दिन में zebrafish भ्रूण को स्थिर पोस्ट निषेचन (dpf) ventral में, पृष्ठीय, या पार्श्व उंमुखीकरण से पहले प्रक्रिया. भ्रूण की इमेजिंग में सहायता करने के लिए, हम भी चैनल के साथ एक सरल उपकरण है कि ओरिएंट 4 zebrafish एक गिलास कवर पर्ची के खिलाफ समानांतर में बाद में बनाया गया है । साथ में, उपकरण है कि हम यहां मौजूद photolithographic दृष्टिकोण की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए zebrafish तकनीकों के अनुकूलन के लिए उपयोगी उपकरणों उत्पंन करते हैं ।
Introduction
Zebrafish कई क्षेत्रों के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है, मौलिक विकास जीव विज्ञान के अध्ययन से बड़े पैमाने पर आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन1,2। इस तरह के जीन के रूप में नियमित आनुवंशिक जोड़तोड़, पछाड़ना, CRISPR/Cas9 mutagenesis, और transgenesis आनुवंशिक सामग्री के microinjection पर एकल सेल युग्मनज, जो सरल, आसान करने के लिए उपयोग के विकास के लिए नेतृत्व किया है में भरोसा, व्यावसायिक रूप से ओरिएंट और इंजेक्शन के लिए अंडे स्थिर3के लिए उपलब्ध उपकरण । प्रत्यारोपण और संक्रमण के रूप में अंय दृष्टिकोण, अक्सर बाद में मंच भ्रूण और बड़े गेज केशिका सुइयों4का उपयोग कर लार्वा में microinjection की आवश्यकता होती है । हालांकि, बड़ा गेज सुई का उपयोग महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह धक्का या भ्रूण रोलिंग के बिना लक्ष्य ऊतक घुसना करने के लिए और अधिक कठिन है । इन शर्तों के तहत, उपयुक्त पानी के लिए भ्रूण को स्थिर जबकि प्रक्रिया के दौरान सुखाने से बचने के लिए आवश्यक तनाव प्राप्त करना मुश्किल है, और भ्रूण आदर्श के लक्ष्य ऊतक में इंजेक्शन के लिए उंमुख नहीं हो सकता है ।
microinjection के बाद, यह अक्सर करने के लिए उन है कि सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया गया है, और प्रारंभिक समय बिंदु की छवियों को पकड़ने का चयन करने के लिए भ्रूण इंजेक्शन स्क्रीन करने के लिए उपयोगी है । इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हम microstructured उपकरणों की एक श्रृंखला विकसित की है कि दोनों microinjection के लिए विभिंन झुकाव में 2 dpf भ्रूण को स्थिर करने में मदद5, और तेजी से छवि आधारित स्क्रीनिंग पोस्ट इंजेक्शन के लिए ।
इन उपकरणों में पर्याप्त संरचनात्मक संकल्प प्राप्त करने के लिए, हम photolithographic तकनीक का उपयोग किया । आमतौर पर microelectronic उद्योगों में इस्तेमाल किया और अधिक हाल ही में microfluidic निर्माण के लिए extrapolated, इन तरीकों ऊर्ध्वाधर 1 से लेकर संरचनाओं को प्राप्त कर सकते हैं-1000 µm, एक अच्छी तरह से zebrafish भ्रूण और लार्वा के हेरफेर के लिए अनुकूल पैमाने. सभी उपकरणों polydimethylsiloxane (PDMS) है, जो सस्ते, शारीरिक रूप से मजबूत, जैविक रूप से निष्क्रिय है, और पारदर्शी का उपयोग कर गढ़े थे ।
Microstructured सतह arrays (MSAs) एक नमूनों शीर्ष सतह के साथ PDMS के ब्लॉक के रूप में स्वरूपित किया गया, आमतौर पर अंडे microinjection के लिए इस्तेमाल किया agarose ब्लॉकों में सरल चैनलों के अनुरूप । इंजेक्शन के बाद स्क्रीनिंग के लिए, 6 इमेजिंग उपकरणों एक मानक गिलास तली हुई 6-अच्छी तरह से थाली में arrayed जा सकता है । इन उपकरणों के भ्रूण के आसान लदान के लिए डिजाइन किए हैं, जबकि अनलोडिंग प्रक्रिया को आसानी से विशिष्ट भ्रूण के बचाव की अनुमति देता है, एक अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से पहले से विकसित उन उपकरणों से छवि आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण को सुविधाजनक बनाने Beebe प्रयोगशाला6.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम हम हाल ही में 2 dpf zebrafish microinjection की सुविधा के लिए विकसित उपकरणों के उपयोग का वर्णन5, और भ्रूण के सुविधाजनक इमेजिंग के लिए एक सरल agarose मुक्त बढ़ते उपकरण परिचय । इन उपकरणों zebrafish तकनीकों के लिए उपयोग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को उदारता से मछलीघर अंतरिक्ष प्रदान करने के लिए डेविड Langenau शुक्रिया अदा करना चाहूंगा; एरिक स्टोन, जॉन सी मूर और zebrafish रखरखाव और रिएजेंट के साथ मदद के लिए किन तांग, और ऐनी Robertson और इलियट Hagedorn लियोनार्ड है Zon लैब से zebrafish यहां इस्तेमाल किया तनाव की खरीद के लिए । वे भी photolithographic तकनीकों पर सलाह के लिए ओक्टेवियो Hurtado शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । FE बच्चों और अमेरिकी ऑस्ट्रेलियाई एसोसिएशन के लिए है Shriner अस्पताल से फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह काम NIH ग्रांट GM92804 द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
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