Microstructured enheter for optimal Microinjection og bildebehandling for sebrafisk larver
Summary
Microinjection av sebrafisk befruktede egg og larver er en avgjørende, men utfordrende teknikken brukes i mange sebrafisk modeller. Her presenterer vi et utvalg av Mikroskala verktøy til hjelp i stabilisering og retningen på sebrafisk for både microinjection og bildebehandling.
Abstract
Sebrafisk har dukket opp som en kraftig modell av ulike menneskelige sykdommer og et nyttig verktøy for en økende rekke eksperimentelle studier, som dekker grunnleggende utviklingsbiologi gjennom til store genetiske og kjemiske skjermer. Men stole mange eksperimenter, spesielt de relatert til infeksjon og xenograft modeller, på microinjection og bildebehandling befruktede egg og larver, som er arbeidskrevende teknikker som krever dyktighet og kompetanse. For å bedre presisjon og gjennomstrømningen av gjeldende microinjection teknikker, vi utviklet en rekke microstructured enheter å orientere og stabilisere sebrafisk embryoer på 2 dager innlegget befruktning (dpf) i ventral, rygg eller sideveis retning før den prosedyre. Til hjelp i avbilding av embryo, utviklet vi også en enkel enhet med kanaler som orientere 4 sebrafisk lateralt parallelt mot en glass cover slip. Sammen demonstrere verktøyene som vi presenterer her effektiviteten av photolithographic å generere nyttig enheter for optimalisering av sebrafisk teknikker.
Introduction
Sebrafisk har dukket opp som en kraftig modell for mange felt, fra studier av grunnleggende utviklingsbiologi til store genetiske og kjemiske skjermene1,2. Rutinemessig genetisk manipulasjon, som gene overuttrykte, knockdown, CRISPR/Cas9 mutagenese og transgenesis er avhengige av microinjection av genetisk materiale i én celle zygoten, som har ført til utviklingen av enkle, lett-å-bruke, kommersielt tilgjengelige verktøy for orientere og stabilisere egg for injeksjon3. Andre tilnærminger, som transplantasjon og smitte, krever ofte microinjection senere stadium embryoer og larver bruker større gauge kapillær nåler4. Men presenterer bruk av større gauge nåler betydelige tekniske utfordringer, som det er vanskeligere å trenge vevet uten pådriver eller bølgende fosteret. Under disse forholdene, kan det ikke være ideelt orientert for injeksjon vevet den aktuelle vann spenning nødvendig for å stabilisere embryoet mens unngå tørking under prosedyren er vanskelig og embryo.
Etter microinjection er det ofte nyttig å skjermen injisert embryo å velge de som har vært vellykket injisert og ta bilder av det første punktet. For å møte disse utfordringene har vi utviklet en rekke microstructured enheter som bidra til å stabilisere 2 dpf embryo i ulike retninger både for microinjection5, og rask bilde-basert screening etter injeksjon.
For å oppnå tilstrekkelig strukturell oppløsning i disse enhetene, benyttet vi photolithographic teknikker. Brukt i microelectronic næringer og mer nylig extrapolated til microfluidic fabrikasjon, kan disse metodene oppnå loddrett strukturer fra 1-1000 µm, en skala godt egnet til manipulering av sebrafisk befruktede egg og larver. Alle enheter ble laget ved hjelp av polydimethylsiloxane (PDMS), som er billige, fysisk robust, biologisk inert og gjennomsiktig.
Microstructured overflate matriser (MSAs) ble formatert som blokker med PDMS med en mønstret overflaten, slik som enkel kanalene i agarose blokker brukte for egg microinjection. For etter injeksjon screening, kan 6 bildeenheter være plassert i en standard glassbunn 6-vel plate. Disse enhetene er designet for enkel innlasting av embryo, mens lossing prosedyren kan redning av bestemte embryoer, tilrettelegge image-basert screening tilnærminger i en mer brukervennlig måte enn disse enhetene tidligere utviklet av den Beebe laboratorium6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi bruk av enheter vi nylig utviklet for å lette 2 dpf sebrafisk microinjection5, og introdusere en enkel agarose uten montering enhet for praktisk bildebehandling av embryo. Disse verktøyene Uthev verktøyet photolithographic teknikker for fabrikasjon av enheter som er nyttig for sebrafisk teknikker.
Vi har funnet MSA enheter spesielt nyttig for injeksjon av celler eller partikler utsatt for aggregering innen microinjection nålen, som sopp conidia elle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne gjerne takke David Langenau for sjenerøst å gi akvariet plass; Eric Stone, John C. Moore og Qin Tang for hjelp med sebrafisk vedlikehold og reagenser, og Anne Robertson og Elliott Hagedorn fra Leonard Zon lab for anskaffelse sebrafisk påkjenningen brukes her. De vil også gjerne takke Octavio Hurtado for råd på photolithographic teknikker. FE ble finansiert av stipend fra Shriner’s Hospital for barn og American australske Association. Dette arbeidet ble finansiert av NIH gi GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
