Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre
Summary
Microinjection des embryons de poisson-zèbre et des larves est une technique cruciale mais difficile utilisée dans de nombreux modèles de poisson-zèbre. Nous présentons ici une gamme d’outils de micro-échelle pour aider à la stabilisation et l’orientation du poisson-zèbre pour microinjection et l’imagerie.
Abstract
Poisson zèbre sont apparus comme un puissant modèle de diverses maladies humaines et un outil utile pour un nombre croissant d’études expérimentales, s’étendant sur la biologie du développement fondamentale grâce aux grands écrans chimiques et génétiques. Cependant, beaucoup d’expériences, en particulier celles relatives à l’infection et des modèles de xénogreffes, dépendre de la microinjection et l’imagerie des embryons et des larves, qui sont laborieux techniques qui requièrent des compétences et l’expertise. Afin d’améliorer la précision et le débit des cours techniques de microinjection, nous avons développé une série de dispositifs microstructurées à orienter et à stabiliser les embryons de poisson-zèbre à 2 jours après la fécondation (dpf) en orientation ventrale, dorsale ou latérale avant le mode opératoire. Pour vous aider dans l’imagerie des embryons, nous avons également conçu un appareil simple avec les canaux qui orientent le poisson-zèbre 4 latéralement en parallèle contre une lamelle de verre. Ensemble, les outils que nous vous présentons ici démontrent l’efficacité des approches photolithographiques pour générer des dispositifs utiles pour l’optimisation des techniques de poisson-zèbre.
Introduction
Poisson zèbre ont émergé comme un puissant modèle pour beaucoup de domaines, des études fondamentales biologie du développement à grande échelle génétique et chimique écrans1,2. Les manipulations génétiques courantes, telles que la surexpression du gène, précipitation, CRISPR/Cas9 mutagénèse et transgénèse dépendent de la microinjection de matériel génétique dans le zygote unicellulaire, qui a conduit au développement de simple, facile à utiliser, dans le commerce outils disponibles pour orienter et stabiliser les oeufs pour injection3. Autres approches, notamment la transplantation et l’infection, nécessitent souvent la microinjection dans plus tard stade embryons et des larves à l’aide de la plus grande jauge aiguilles capillaire4. Cependant, l’utilisation d’aiguilles de calibre plus gros présente des défis techniques importants, car il est plus difficile de pénétrer le tissu cible sans pousser ou rouler l’embryon. Dans ces conditions, obtenir la tension de l’eau approprié pour stabiliser l’embryon tout en évitant le séchage au cours de la procédure est difficile et les embryons peut-être être pas idéalement orienté pour injection dans le tissu cible.
Après microinjection, il est souvent utile dépister des embryons injectées pour sélectionner celles qui ont été injectés avec succès et de capturer des images de l’instant initial. Pour relever ces défis, nous avons développé une gamme d’appareils microstructurées qui aident à stabiliser les 2 embryons dpf dans différentes orientations pour microinjection5, ainsi que pour le dépistage rapide basé sur une image après l’injection.
Pour obtenir une résolution structurelle suffisante dans ces dispositifs, nous avons utilisé des techniques photolithographiques. Couramment utilisé dans les industries microélectroniques et plus récemment extrapolés à la fabrication de la microfluidique, ces approches peuvent atteindre les structures verticales allant de 1-1 000 µm, une échelle, bien adaptée à la manipulation des embryons de poisson-zèbre et des larves. Tous les appareils ont été fabriqués à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS), ce qui est bon marché, physiquement robuste, biologiquement inerte et transparent.
Tableaux de surfaces microstructurées (MSAs) ont été mis en forme comme des blocs de PDMS avec une surface supérieure à motifs, analogue aux canaux simples dans les blocs d’agarose couramment utilisés pour le microinjection d’oeuf. Pour le dépistage après l’injection, 6 appareils d’imagerie peuvent être disposés dans un plat de 6 puits à fond de verre standard. Ces appareils sont conçus pour faciliter le chargement des embryons, alors que la procédure de déchargement permet idéalement sauvetage d’embryons spécifiques, facilitant l’imageur approches de dépistage d’une manière plus conviviale que ces dispositifs précédemment développé par le Beebe laboratoire6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici l’utilisation de périphériques, nous avons développé récemment pour faciliter 2 dpf zebrafish microinjection5et mettre en place un dispositif simple montage sans gel d’agarose pour l’imagerie commode d’embryons. Ces outils mettent en évidence l’utilité des techniques photolithographiques pour la fabrication de dispositifs utiles pour les techniques de poisson-zèbre.
Nous avons identifié les dispositifs MSA particulièrement utile p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier David Langenau qui généreusement l’espace aquarium ; Eric Stone, John C. Moore et Qin Tang pour aident avec la maintenance de poisson-zèbre et réactifs et Anne Robertson Elliott Hagedorn du laboratoire de Leonard Zon pour se procurer la souche de poisson-zèbre utilisée ici. Ils tiens également à remercier Octavio Hurtado pour obtenir des conseils sur les techniques photolithographiques. FE a été financée par les bourses de recherche de l’Hôpital Shriners pour enfants et l’Association américaine de l’australien. Ce travail a été financé par les NIH grant GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
References
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