बरकरार का अलगाव, पूरे माउस Extracellular मैट्रिक्स अभिव्यक्ति और ग्रंथि विज्ञान के विश्लेषण के लिए स्तन ग्रंथियों
Summary
यहाँ, हम extracellular मैट्रिक्स (ECM) अभिव्यक्ति और डक्टर आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए पूरे, बरकरार माउस स्तन ग्रंथियों के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. माउस #4 पेट ग्रंथियों 8-10 सप्ताह पुराने महिला nulliparous चूहों से निकाले गए थे, तटस्थ बफर formalin में तय, खोदी और दाग ECM प्रोटीन के लिए immunohistochemistry का उपयोग कर ।
Abstract
इस प्रक्रिया का लक्ष्य ECM अभिव्यक्ति और डक्टर वास्तुकला का आकलन करने के क्रम में महिला nulliparous चूहों से #4 उदर स्तन ग्रंथियों फसल के लिए किया गया था । यहां, त्वचा के नीचे एक छोटी जेब मेयो कैंची का उपयोग कर बनाया गया था, अंतर्निहित से चमड़े के नीचे ऊतक के भीतर ग्रंथियों की जुदाई की अनुमति । ग्रंथियों के दृश्य 3.5 x-R सर्जिकल माइक्रो loupes के उपयोग से सहायता प्राप्त किया गया था । खाल औंधा और वापस बरकरार स्तन वसा पैड की पहचान की अनुमति टिकी थी । #4 उदर ग्रंथियों में से प्रत्येक कुंद स्केलपेल ब्लेड बाद में चमड़े के नीचे परत और ग्रंथियों के बीच फिसलने से विच्छेदित किया गया । तुरंत बाद फसल, ग्रंथियों के बाद ऊतक प्रसंस्करण के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में रखा गया था । संपूर्ण ग्रंथि के उत्पाद लाभप्रद है क्योंकि यह मुख्य रूप से महत्वपूर्ण ऊतक-प्रडक्टर उपकला कोशिकाओं और अंय microenvironmental सेलुलर आबादी है कि एक आंशिक बायोप्सी में याद किया जा सकता है के बीच व्यापक बातचीत को छोड़कर के जोखिम को समाप्त । पद्धति का एक दोष निश्चित ऊतकों से धारावाहिक वर्गों का उपयोग करता है जो ग्रंथि के भीतर असतत स्थानों के लिए डक्टर morphogenesis और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण की सीमा है । जैसे, वाहिनी वास्तुकला में परिवर्तन और 3 आयामों में प्रोटीन अभिव्यक्ति (3 डी) आसानी से प्राप्य नहीं है । कुल मिलाकर, तकनीक इस तरह के विकास वाहिनी morphogenesis या स्तन कैंसर के रूप में बहाव की जांच के लिए पूरी बरकरार murine स्तन ग्रंथियों की आवश्यकता के अध्ययन के लिए लागू है ।
Introduction
स्तन कैंसर ऊतक फाइब्रोसिस1,2,3,4की एक पर्याप्त डिग्री की विशेषता है । ECM के रूप में संदर्भित, इस गैर सेलुलर इकाई सभी ऊतकों में डिग्री बदलती में पाया जाता है और मुख्य रूप से fibrillar और गैर fibrillar कोलेजन, elastin, और विभिन्न संकेतात्मक अणुओं है कि कर रहे हैं के अलावा नच के एक जटिल meshwork के शामिल है इस मैट्रिक्स में तनहा । समस्थिति शर्तों के तहत, ECM के जमाव और क्षरण कसकर नियंत्रित है । 5 स्तन tumorigenesis के दौरान, ECM जमाव और क्षरण का संतुलन बाधित होता है । जैसे, स्तन ट्यूमर के लिए दूसरों के बीच जैसे कोलेजन, fibronectin और tenascin-सी के रूप में प्रचुर मात्रा में ECM प्रोटीन व्यक्त की सूचना दी गई है । 6 मैट्रिक्स crosslinking के बढ़ा पैटर्न के अलावा इन प्रोटीन के असामांय अभिव्यक्ति स्तन ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस और थेरेपी प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए प्रलेखित किया गया है1,3, 4,7,8,9.
ECM रचना और डक्टर आकृति विज्ञान, बरकरार स्तन ग्रंथियों के अलगाव का आकलन करने के लिए किया गया था । यहां, हम caveolin-1, एक अभिंन झिल्ली प्रोटीन जो एक आक्रामक स्तन ट्यूमर हस्ताक्षर करने के लिए जोड़ा गया है10,11,12, और नियंत्रण महिला nulliparous B6 के लिए कमी महिला nulliparous चूहों का इस्तेमाल किया चूहों. ऊतकीय प्रसंस्करण और इन ऊतकों के दाग डक्टर आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन के साथ साथ कई ECM प्रोटीन की पहचान की अनुमति दी ।
कुल मिलाकर, पूर्ण, बरकरार स्तन ग्रंथियों के अलगाव शोधकर्ताओं ऊतक चौड़ा रूपात्मक या सेलुलर exogenous या अंतर्जात कारकों के जवाब में होने वाले परिवर्तनों की जांच करने का अवसर देता है । तकनीक की कमियां 2 आयाम के विश्लेषण के साथ जुड़े रहे है (2d) ऊतक वर्गों के रूप में एक 3 डी परिप्रेक्ष्य है, जो डक्टर पेड़ के परिसर आकृति विज्ञान की एक और पूरी तस्वीर उपज होगा विरोध किया । कोशिका-कोशिका और कोशिका-ECM बातचीत की जटिलता को देखते हुए कि स्तन ग्रंथि में जगह ले, पूरे के अलगाव, बरकरार ग्रंथियों कुशलतापूर्वक murine स्तन के विभिंन क्षेत्रों में डक्टर आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण के लिए लाभप्रद है ग्रंथ.
Protocol
इस प्रोटोकॉल में पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और Osteopathic चिकित्सा के फिलाडेल्फिया कॉलेज के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित और सभी तकनीकों के तहत किए गए थे सख्त नै…
Representative Results
Discussion
कागज में, हम एक तकनीक का वर्णन किया है के लिए बरकरार माउस स्तन ग्रंथियों को अलग ECM अभिव्यक्ति और डक्टर आकृति विज्ञान के बहाव ऊतकीय विश्लेषण के लिए । वाहिनी आकृति विज्ञान के विश्लेषण के संबंध में, इस पद्ध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अप्रैल वाईल् और डॉ रोजर Broderson पशु necropsy और ग्रंथि अलगाव के साथ सहायता के लिए, क्रमशः स्वीकार करना चाहते हैं । इस काम के लिए धन उंर बढ़ने के पुराने विकारों के लिए Osteopathic चिकित्सा केंद्र के फिलाडेल्फिया कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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