Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.
Abstract
El objetivo de este procedimiento era el #4 abdominal las glándulas mamarias de ratones femeninos nulíparas la cosecha con el fin de evaluar la expresión de ECM y arquitectura ductal. Aquí, un pequeño bolsillo debajo de la piel fue creado usando las tijeras de Mayo, permitiendo la separación de las glándulas en el tejido subcutáneo desde el peritoneo subyacente. Visualización de las glándulas fue ayudado por el uso de 3.5 lupas micro quirúrgicas x-R. La piel fue invertida y cubrió atrás que permite identificación de las almohadillas de grasa mamarias intactas. Cada una de las glándulas abdominales #4 fue disecada sin rodeos deslizando lateralmente la hoja de bisturí entre las glándulas y la capa subcutánea. Inmediatamente después de la cosecha, las glándulas se colocaron en 10% formalina tamponada neutra para el procesamiento posterior del tejido. Supresión de la glándula entera es ventajosa ya que sobre todo elimina el riesgo de excluir interacciones importantes de todo el tejido entre las células epiteliales ductales y otras poblaciones celulares microambiental que podrían perderse en una biopsia parcial. Uno de los inconvenientes de la metodología es el uso de secciones seriadas de tejidos fijadas que limita el análisis de expresión proteína y morfogénesis ductal a lugares discretos dentro de la glándula. Como tal, cambios en la expresión de proteína y arquitectura ductal en 3 dimensiones (3D) no es fácilmente obtenible. En general, la técnica es aplicable a los estudios que requiere todo intactas glándulas mamarias murinas para investigaciones posteriores tales como desarrollo cáncer ductal de morfogénesis o mama.
Introduction
El cáncer de mama se caracteriza por un grado considerable de tejido fibrosis1,2,3,4. Conocido como ECM, esta entidad no celular se encuentra en diferentes grados en todos los tejidos y se compone principalmente de una compleja red de colágenos fibrilares y no fibrilares, elastina y glicoproteínas además varias moléculas de señalización que son secuestrado en esta matriz. En condiciones homeostáticas, la deposición y la degradación de la ECM se controla bien. 5 durante la tumorogénesis de mama, se perturba el equilibrio de la deposición del ECM y la degradación. Así, tumores de mama se han divulgado para expresar proteínas ECM abundantes tales como colágenos, fibronectina y Tenascina-C entre otros. 6 la expresión anormal de estas proteínas además de más patrones de entrecruzamiento de la matriz se ha documentado para promover mama tumor metástasis, terapia y evolución resistencia1,3, 4,7,8,9.
Evaluar la composición del ECM y la morfología ductal, se realizó aislamiento de glándulas mamarias intactas. Aquí hemos utilizado mujeres nulíparas ratones deficientes de caveolina-1, una proteína integral de membrana que se ha ligado a una agresiva mama tumor firma10,11,12, controlar mujeres nulíparas B6 ratones. Procesamiento histológico y la coloración de estos tejidos permiten la identificación de varias proteínas de la ECM junto con la caracterización de la morfología ductal.
En general, el aislamiento de las glándulas mamarias enteros, intactos da a investigadores la oportunidad de investigar todo el tejido celulares o morfológicos cambios que ocurren en respuesta a factores exógenos o endógenos. Inconvenientes de la técnica están relacionadas con el análisis de secciones de tejido de 2 dimensiones (2D) en contraposición a una perspectiva 3D, que daría una imagen más completa de la morfología compleja del árbol ductal. Dada la complejidad de las interacciones célula-célula y célula-ECM que se producen en la glándula mamaria, el aislamiento de glándulas enteras, intactas es ventajoso para analizar eficientemente ductal expresión morfología y de la proteína en varias regiones de la mamario murino glándula.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el papel, hemos descrito una técnica para aislar las glándulas mamarias de ratón intacto para análisis histológicos aguas abajo de ECM expresión y morfología ductal. Con respecto al análisis de la morfología ductal, esta metodología permite la rápida investigación de arquitectura ductal con sede fuera de las secciones histológicas teñidas. Otros métodos de análisis ductales dependen de inyecciones de colorantes para permitir la visualización del árbol ductal, métodos que pueden ser técnicamente dif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer engaños abril y Dr. Roger Broderson de asistencia con animal necropsia y aislamiento de la glándula, respectivamente. Fondos para este trabajo fue apoyado por los centros de la Philadelphia College of Osteopathic Medicine para trastornos crónicos del envejecimiento.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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