Isolering av intakt, hela musen mjölkkörtlar för analys av extracellulärmatrix uttryck och körtel morfologi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av hela, intakt mus mjölkkörtlar för att undersöka extracellulär matrix (ECM) uttryck och duktal morfologi. Mus #4 buk körtlar utvanns från 8-10 vecka gammal dräktiga honmöss, fixeras i neutral buffrad formalin, sektioneras och färgas med immunohistokemi för ECM proteiner.
Abstract
Målet med detta förfarande var att skörda #4 buk mjölkkörtlar från dräktiga honmöss för att bedöma ECM uttryck och duktal arkitektur. Här, skapades en liten ficka under huden med Mayo sax, så att separationen av körtlar inom den subkutana vävnaden från underliggande bukhinnan. Visualisering av körtlar var hjälpt av användningen av 3.5 x-R kirurgiska micro luppar. Pelt var inverterad och nålas tillbaka möjliggör identifiering av de intakta mjölkkörtlar fett kuddar. Var och en av #4 buk körtlar var rakt på sak dissekeras av glidning skalpell bladet sidled mellan den subkutana vävnaden och körtlar. Omedelbart efter skörd, körtlar placerades i 10% neutral buffrad formalin för efterföljande vävnad bearbetning. Excision av hela körteln är fördelaktigt eftersom det primärt eliminerar risken för exklusive viktigt vävnad-wide interaktioner mellan duktal epitelial celler och andra microenvironmental cellulära populationer som kan missas i en partiell biopsi. En nackdel med metoden är användning av seriell avsnitt från fasta vävnader vilket begränsar analyser av duktal morfogenes och protein uttryck till diskreta platser i körteln. Som sådan, förändringar i duktal arkitektur och protein uttryck i 3 dimensioner (3D) är inte lätt kan anskaffas. Övergripande, tekniken är tillämpliga på studier som kräver helt intakt murina mjölkkörtlar för nedströms utredningar såsom utvecklingsmässiga duktal morfogenes eller bröst cancer.
Introduction
Bröstcancer är kännetecknas av en betydande grad av vävnad fibros1,2,3,4. Kallad ECM, icke-cellulär entiteten finns i varierande grad i alla vävnader och består primärt av en komplex meshwork av fibrillar och icke-fibrillar kollagen, elastin och glykoproteiner förutom olika signalmolekyler som är binds i denna matris. Homeostatiska villkor kontrolleras tätt den nedfall och nedbrytning av ECM. 5 under bröstet uppkomst störs balansen i ECM nedfall och nedbrytning. Som sådan, rapporterats brösttumörer att uttrycka riklig ECM proteiner såsom kollagen, Fibronektin och tenascin-C bl.a. 6 onormal uttrycket av dessa proteiner förutom ökad mönster av matrix crosslinking har dokumenterats för att främja bröstcancer tumör progression, metastaser och terapi motstånd1,3, 4,7,8,9.
För att bedöma ECM sammansättning och duktal morfologi, utfördes isolering av intakt bröstkörtlarna. Här använde vi dräktiga honmöss bristfällig för caveolin-1, en integrerad membranprotein som har kopplats till en aggressiv bröstcancer tumör signatur10,11,12, och styra kvinnliga dräktiga B6 möss. Histologisk bearbetning och färgning av dessa vävnader tillåtna identifiering av flera ECM proteiner tillsammans med karakterisering av duktal morfologi.
Sammantaget ger isolering av hela, intakt bröstkörtlarna forskare möjlighet att undersöka vävnad-wide morfologiska eller cellulära förändringar som sker i svar på exogena och endogena faktorer. Nackdelar med tekniken är associerade med analyser av 2 dimension (2D) vävnadssnitt i motsats till ett 3D-perspektiv, vilket skulle ge en mer fullständig bild av trädet duktal komplexa morfologi. Tanke på komplexiteten i cell-cell och cell-ECM interaktioner som sker i bröstkörteln, är isolering av hela, intakt körtlar fördelaktigt för att effektivt analysera duktal morfologi och protein uttryck i olika regioner för murint mjölkkörtlar körtel.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tidningen, har vi beskrivit en teknik för att isolera intakt mus mjölkkörtlar för efterföljande histologiska analyser av ECM uttryck och duktal morfologi. När det gäller analyser av duktal morfologi möjliggör denna metod snabb utredning av duktal arkitektur baserad bort av färgade histologiska sektioner. Andra metoder för duktal analyser är beroende av injektioner av färgämnen att aktivera visualisering av duktal träd, metoder som kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna April Wiles och Dr. Roger Broderson för hjälp med animaliskt obduktion och körtel isolering, respektive. Finansiering för detta arbete stöddes av Philadelphia College of Osteopatisk medicin Centers för kroniska sjukdomar av åldrande.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
