अलगाव साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त Phagosomes का
Summary
हम यहां के अलगाव के लिए एक सरल और त्वरित विधि का वर्णन साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त phagosomes द्वारा बायोटिन और streptavidin के साथ बैक्टीरिया कोटिंग ।
Abstract
साल्मोनेला typhimurium एक facultative intracellular जीवाणु है जो मनुष्यों में आंत्रशोथ का कारण बनती है । लेमिना propria के आक्रमण के बाद एस. typhimurium बैक्टीरिया जल्दी से पता चला और मैक्रोफेज द्वारा phagocytized हैं, और phagosomes के रूप में जाना जाता बुलबुले में निहित क्रम में नीचा होना करने के लिए. एस के अलगाव । typhimuriumयुक्त phagosomes व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए किया गया है कैसे एस । typhimurium संक्रमण phagosome परिपक्वता की प्रक्रिया जीवाणु क्षरण को रोकने के लिए बदल जाता है । प्रतिष्ठित, बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक द्वारा किया गया है । हालांकि, इस प्रक्रिया को समय लेने वाली है, और विशेष उपकरणों और निपुणता की एक निश्चित डिग्री की आवश्यकता है । यहां वर्णित है के अलगाव के लिए एक सरल और त्वरित विधि है एस. बायोटिन-streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ जीवाणुओं को कोटिंग द्वारा मैक्रोफेज से phagosomes युक्त typhimurium। Phagosomes इस विधि द्वारा प्राप्त की पसंद के किसी भी बफर में निलंबित किया जा सकता है, की अनुमति परख की एक व्यापक रेंज के लिए अलग Phagosomes के उपयोग, जैसे प्रोटीन, metabolite, और लिपिड विश्लेषण के रूप में । संक्षेप में, एस के अलगाव के लिए इस विधि . typhimuriumयुक्त phagosomes विशिष्ट है, कुशल, तेजी से, ंयूनतम उपकरण की आवश्यकता है, और अधिक सुक्रोज ढाल-ultracentrifugation द्वारा अलगाव की शास्त्रीय विधि से बहुमुखी है ।
Introduction
मैक्रोफेज विशेष phagocytic कोशिकाओं है कि पता लगाने, निगल जाना, और परिधीय ऊतकों में मौजूद किसी भी विदेशी कण नीचा, अपोप्तोटिक कोशिकाओं से लेकर ऐसे बैक्टीरिया के रूप में सूक्ष्मजीवों पर हमला करने के लिए घूम रहे हैं । सतह पर रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता रोगजनकों की सतह पर सामान्यतः मौजूद सूक्ष्मजीवों (रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न या PAMPs के रूप में जाना जाता है), मैक्रोफेज सेलुलर झिल्ली के एक जटिल पुनर्गठन शुरू आदेश को चारों ओर और phagocytize रोगज़नक़1।
घिरा हुआ रोगज़नक़ तो phagosome के रूप में जाना जाता पुटिका एक intracellular में macrophage द्वारा निहित है । ऐसे endosomes और lysosomes के रूप में अंय बुलबुले के साथ फ्यूजन और विखंडन की घटनाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से, रोगज़नक़ युक्त phagosome phagosomal सामग्री के उंमूलन के लिए आवश्यक प्रोटीन का एक सेट का अधिग्रहण । इसलिए, इस प्रक्रिया के दौरान, phagosome परिपक्वता2के रूप में जाना जाता phagosome की एंजाइमी संरचना उच्च चर है ।
शीघ्र ही phagocytosis के बाद, multimeric जटिल vacuolar ATPase (वी-ATPase) phagosome झिल्ली में शामिल किया गया है के साथ फ्यूजन द्वारा के रूप में3. इस जटिल phagosome के लुमेन के लिए cytosol से प्रोटॉन पंप करने के लिए एटीपी का उपयोग4. phagosome के अंलीकरण अन्य बुलबुले के साथ फ्यूजन की घटनाओं के लिए आवश्यक है5 और पीएच-निर्भर degradative एंजाइमों की एक बड़ी संख्या के सक्रियण के लिए6. phagosome झिल्ली पर जल्दी इकट्ठे होने वाला एक अन्य multimeric एंजाइमी कॉम्प्लेक्स NADPH-oxidase (NOX) कॉम्प्लेक्स है. NOX जटिल ऑक्सीकरण NADPH के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) है कि phagosome लुमेन में स्रावित कर रहे हैं और महत्वपूर्ण है कि काफी मारे गए सूक्ष्मजीवों की हत्या करने के लिए योगदान का उत्पादन करने के लिए7.
परिपक्वता के प्रारंभिक चरणों के दौरान, phagosomes वर्तमान मार्करों आम तौर पर ऐसे Rab5 और Rab7 के रूप में जल्दी और देर endosomes के वी0 उप इकाई के साथ क्रमशः वी ATPase8। lysosomes के साथ phagosomes का फ्यूजन और देर से endosomes परिणाम phagocytized रोगज़नक़ के जोखिम में hydrolytic एंजाइमों की एक विस्तृत विविधता जैसे cathepsin के लिए, lipases, और β-galactosidase9. लुमेन के अंलीकरण भी इन एंजाइमों के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, cathepsin डी की दरार सक्रिय लघु फार्म का उत्पादन करने के लिए पीएच-निर्भर10है । इन एंजाइमों रोगज़नक़ नीचा और रोगज़नक़ के उत्पादन-व्युत्पंन लघु पेप्टाइड्स कि macrophage मेजर histocompatibility परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय के अणुओं टी कोशिकाओं के लिए एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं11।
इसलिए, phagosome परिपक्वता सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है और प्रतिरक्षा प्रणाली के सहज और अनुकूली हथियार लिंक । यह कोई आश्चर्य की बात है कि रोगज़नक़ों रणनीतियों विकसित किया है इसके बाद के संस्करण phagosome परिपक्वता की प्रक्रिया वर्णित के माध्यम से मैक्रोफेज द्वारा उंमूलन पर काबू पाने के । उदाहरण के लिए, intracellular बैक्टीरिया माइकोबैक्टीरियम तपेदिक और Legionella pneumophila बाधित वी phagosome विधानसभा और फलस्वरूप लुमेन ATPase12,13 से अंलीकरण परिपक्वता को रोकने . लिस्टिरिया monocytogenes या शिगेला flexneri के रूप में अन्य बैक्टीरिया, phagosome झिल्ली में cytosol14,15में बचने के लिए ताकना गठन प्रेरित । दूसरी ओर, साल्मोनेला enterica serovar typhimurium (एस. typhimurium) vacuole के भीतर phagosome के गुणों को संशोधित करने के लिए इसे अपनी प्रतिकृति16के लिए एक उपयुक्त स्थान में रूपांतरित करने में सक्षम है । यह क्षमता बनाता है एस । typhimurium एक बहुत ही दिलचस्प मॉडल रोगज़नक़ phagosome परिपक्वता के मध्यस्थता हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए ।
एस typhimurium एक facultative intracellular जीवाणु है जो मनुष्यों में आंत्रशोथ का कारण बनता है । लेमिना propria के आक्रमण के बाद, एस. Typhimurium बैक्टीरिया जल्दी से पता चला और मैक्रोफेज द्वारा phagocytized हैं, और phagosomes17के भीतर समाहित । कुछ रिपोर्ट्स पहले बताई गई है कि S. typhimurium-युक्त phagosomes दोनों endosomes और lysosomes18के लिए वर्तमान निर्माताओं, और अंय अध्ययनों से पाया है phagosome-lysosome फ्यूजन पर रोक लगा एस । Typhimurium संक्रमण१९.
प्रारंभ में, phagosome परिपक्वता पर एस । typhimurium संक्रमण इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई है । बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव के लिए तकनीक का विकास endosome और lysosome मार्करों के मामले में phagosome सामग्री का एक और अधिक सटीक अध्ययन सक्षम होना चाहिए । तिथि करने के लिए, बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव के लिए इस्तेमाल मुख्य विधि सुक्रोज कदम ढाल पर उपसेलुलर अंश है18,20. हालांकि, इस विधि phagosomes करने के लिए यांत्रिक क्षति पैदा कर सकते हैं, जो कई केंद्रापसारक चरणों की आवश्यकता है, phagosomal घटकों की स्थिरता (प्रोटीन और लिपिड) को प्रभावित कर सकते हैं, और समय लेने वाला है । इसके अलावा, यह एक ultracentrifuge के उपयोग की आवश्यकता है: विशेष उपकरणों का एक टुकड़ा है कि हर प्रयोगशाला के लिए सुलभ नहीं है ।
हाल ही में, बैक्टीरिया युक्त phagosomes के अलगाव के लिए एक नया दृष्टिकोण लागू किया गया है, जिसमें बैक्टीरियल रोगजनकों biotinylated lipopetide (Lipobiotin) के साथ लेबल और बाद में streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोती का उपयोग कर निकाले जाते हैं21 . हम बैक्टीरियल सतह अमीन-एन एच एस-बायोटिन के साथ अणुओं युक्त streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों द्वारा पीछा लेबल द्वारा एक वैकल्पिक पूरक पद्धति का प्रस्ताव । इस विधि द्वारा प्राप्त Phagosomes अत्यधिक endosome और lysosome मार्करों में समृद्ध कर रहे है और परख की एक व्यापक रेंज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन विश्लेषण से ओमिक्स विश्लेषण के लिए । इसके अतिरिक्त, यह विशेष उपकरणों जैसे ultracentrifuges की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, केंद्रापसारक कदम को नष्ट करने से, दोनों phagosomes को यांत्रिक क्षति और कार्यरत समय की राशि काफी कम कर रहे हैं । इस पद्धति को अन्य जीवाणुओं से युक्त phagosomes के अलगाव के लिए आसानी से रूपांतरित किया जा सकता है, जैसे चना-पॉजिटिव Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुसभी इस पांडुलिपि में शामिल है. संक्षेप में, एस के अलगाव के लिए इस विधि . typhimuriumयुक्त phagosomes एक सरल, लागत प्रभावी है, और सुक्रोज ढाल-ultracentrifugation द्वारा शास्त्रीय अलगाव की तुलना में कम समय लेने, अत्यधिक समृद्ध बैक्टीरिया युक्त phagosomes प्रतिपादन ।
Protocol
सभी कदम रोगजनक एस के उपयोग से जुड़े typhimurium को बीएसएल-2 या उच्चतर जैविक सुरक्षा स्तर की सुविधा में कार्यांवित किया जाना चाहिए । एस की संस् कृति और कोटिंग Typhimurium, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अस?…
Representative Results
Discussion
एस के अलगाव के लिए एक नई विधि . typhimurium-युक्त phagosomes कोटिंग द्वारा बायोटिन और streptavidin-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ बैक्टीरिया यहाँ वर्णित है. कोशिका झिल्ली के कोमल विघटन के बाद, बैक्टीरिया युक्त phagosomes आ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
है रॉबिंसन प्रयोगशाला में अनुसंधान में सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं पर कोलोन उत्कृष्टता क्लस्टर से धन द्वारा समर्थित है उंर बढ़ने-जुड़े रोगों, कोलोन विश्वविद्यालय, जर्मनी (CECAD; जर्मन संघीय की उत्कृष्टता पहल के भीतर DFG द्वारा वित्त पोषित और राज्य सरकारों) और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB ६७०), Köln फॉर्च्यून, और मारिया-Pesch कोलोन, जर्मनी के विश्वविद्यालय के फाउंडेशन से अनुदान ।
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
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