巨噬细胞中含有吞噬的鼠伤寒沙门氏菌的分离
Summary
我们在这里描述了一个简单和快速的方法, 以隔离的鼠伤寒沙门氏菌-含有吞噬从巨噬细胞涂层细菌与生物素和亲和。
Abstract
鼠伤寒沙门氏菌是一种在人类中引起胃肠炎的兼胞内细菌。入侵后的叶片固有, S.鼠伤寒杆菌细菌被巨噬细胞快速检测和吞噬, 并被称为吞噬的囊泡, 以使其降解。隔离S.包含吞噬的沙门氏菌已被广泛用于研究S.沙门氏菌感染会改变体成熟的过程, 以防止细菌降解。采用蔗糖梯度离心法对含菌吞噬进行了分离。然而, 这个过程是费时的, 需要专门的设备和一定程度的灵巧。这里描述的是一个用于隔离 S 的简单而快速的方法.鼠伤寒-含有吞噬从巨噬细胞通过涂层细菌与生物素-亲和共轭磁珠。通过这种方法获得的吞噬可以悬浮在任何选择的缓冲液中, 使分离的吞噬的使用范围广泛, 如蛋白质、代谢物和脂质分析。总之, 此方法用于隔离S.含有吞噬的鼠伤寒杆菌是特定的、高效的、快速的, 需要最少的设备, 并且比传统的蔗糖梯度离心方法更具通用性。
Introduction
巨噬细胞是循环的专门的吞噬干细胞, 可以检测、吞噬和降解外周组织中的任何外来微粒, 从凋亡细胞到入侵微生物, 如细菌。表面受体介导的病原体特异标记物的识别通常存在于微生物的表面 (称为病原体相关的分子模式或 PAMPs), 巨噬细胞启动一个复杂的细胞膜重组为了包围和吞噬病原体1。
吞噬的病原体然后被巨噬细胞所包含的细胞内囊泡称为体。通过一系列的融合和裂变事件与其他囊泡, 如体和溶酶体, 包含体获得了一套蛋白质, 需要消除 phagosomal 的内容。因此, 体的酶组成在这个过程中是高度可变的, 被称为体成熟的2。
吞噬后不久, multimeric 复合泡 atp 酶 (v atp 酶) 被纳入体膜融合与体3。这个复合体利用 ATP 泵浦质子从胞到腔的体4。体的酸化是必要的为融合事件与其他泡5和为激活许多 pH 依赖性降解酵素6。在体膜上快速组装的另一种 multimeric 酶复合物是氧化酶 (NOX) 复合物。为了产生活性氧 (ROS) 分泌到体腔内, 并大大有助于杀死被吞噬的微生物7, 氮氧化物复合物氧化。
在成熟的初始步骤, 吞噬目前的标记通常如 Rab5 和 Rab7 的早期和晚期体分别与 v 型 atp 酶8的 v-0亚基。吞噬与溶酶体和晚期体的融合导致吞噬病原菌暴露于多种水解酵素, 如蛋白酶蛋白酶、脂肪酶和β-乳糖9。对这些酶的活化也需要管腔的酸化。例如, 蛋白酶 D 的裂解产生活性的短形式是 pH 依赖性的10。这些酶降解病原体, 并调解由巨噬细胞主要组织相容性复合物 (MHC) II 类分子向 T 细胞提出的病原体衍生短肽的产生, 以触发自适应免疫应答11。
因此, 体成熟对先天免疫反应至关重要, 并与免疫系统的先天和适应性武器联系在一起。这并不奇怪, 病原体已经进化的战略, 以克服由巨噬细胞通过上述的体成熟的过程。例如, 胞内细菌结核分枝杆菌和军团肺通过抑制 v atp 酶的组装和相应的流明酸化, 防止体成熟,12,13.其他细菌如李斯特菌或志贺氏杆菌福氏诱导体膜中的孔隙形成, 以逃逸到胞14,15。另一方面,沙门氏菌 enterica螺旋体鼠伤寒杆菌 (S。沙门氏菌)能够修改液泡内体的属性, 将其转换为其复制16的合适位置。此功能使S.沙门氏菌是研究病原体介导的体成熟干预的一个非常有趣的模型。
S. 鼠伤寒是一种在人类中引起胃肠炎的兼胞内细菌。在侵入固有后, S.鼠伤寒杆菌快速检测和吞噬的巨噬细胞, 并包含在吞噬17。一些报告以前曾描述过S.沙门氏菌-包含吞噬目前的制造商为体和溶酶体18, 和其他研究发现体-溶融合阻止后, S.鼠伤寒病毒感染19。
最初, 体成熟于S.用免疫荧光显微镜对鼠伤寒杆菌感染进行了研究。在分离细菌的吞噬技术的发展使更准确的研究体的内容, 从 endosome 和溶标记。迄今为止, 用于分离细菌的吞噬的主要方法是蔗糖梯度的亚细胞分馏18,20。然而, 这种方法需要多个离心步骤, 可以造成机械损伤的吞噬, 可能会影响稳定的 phagosomal 组分 (蛋白质和血脂), 是费时。此外, 它还需要使用 ultracentrifuge: 一个专门的设备, 这是无法进入每个实验室。
最近, 一种新的方法已被用于分离细菌含有吞噬, 其中细菌病原体被标记为化 lipopetide (Lipobiotin), 后来提取使用亲和共轭磁珠21.我们提出了一种替代的补充方法, 标记细菌表面胺类大分子与 NHS-生物素后, 亲和共轭磁珠。该方法获得的吞噬在 endosome 和溶标记物中具有很高的丰富性, 可用于多种测定, 从蛋白质分析到学分析。此外, 它不需要专门的设备, 如超速。此外, 通过消除离心步骤, 吞噬的机械损伤和使用的时间都大大减少。这种方法可以很容易地适应隔离的吞噬含有其他细菌, 如革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌, 也包括在这份手稿。总之, 此方法用于隔离S.含有吞噬的鼠伤寒杆菌是一种简单、cost-effective 且耗时较传统的蔗糖梯度分离法, 离心, 呈现高浓度的含菌吞噬。
Protocol
Representative Results
Discussion
用于隔离S的新方法本文介绍了用生物素和亲和-共轭磁珠吞噬细菌的方法. 在细胞膜的轻微破坏后, 含有细菌的吞噬可以很容易地用磁性齿条来提取。我们表明, 细菌的标记保留了病原体诱导炎症的能力, 不会改变宿主细胞的吞噬特性。重要的是, 这种方法获得的吞噬丰富的细菌和 endosome/溶标记和缺乏胞浆污染。
与传统的采用蔗糖梯度分离法的体分离方法相比, 该?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在罗宾逊实验室的研究得到了来自科隆卓越集团的资助, 这是关于衰老相关疾病的细胞应激反应的支持, 德国科隆大学 (CECAD; 由 DFG 在德国联邦的卓越主动性之内资助和州政府) 和赠款从德意志 Forschungsgemeinschaft (SFB 670), 科隆财富和玛丽亚-Pesch 基金会的德国科隆大学。
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
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