סינתזה והערכה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי מבוססי רותניום
Summary
פרוטוקול עבור סינתזה, טיהור, אפיון מעכב מבוססי רותניום של ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי מוצג. הליך כדי להעריך את יעילותה בתאים בתרבית של permeabilized הוא הפגין.
Abstract
אנו מפרטים את סינתזה ולטיהור סידן מיטוכונדריאלי מעכב ספיגת, [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 +. הסינתזה אופטימיזציה של מתחם זה מתחילה [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 ב 1 מ’ NH4או במיכל סגור, מניב פתרון ירוק. טיהור מתבצע עם כרומטוגרפיה קטיונים. מתחם זה מאופיין, אומתו ספקטרוסקופיה מול UV ו- IR כדי להיות טהורים. המאפיינים המעכבת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי הם העריכו בתאים הלה permeabilized על-ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה.
Introduction
סידן מיטוכונדריאלי הוא מווסת מפתח עבור מספר תהליכים חיוניים לתפקוד תאים נורמליים, כולל הפקת אנרגיה אפופטוזיס. 1 , 2 , 3 uniporter סידן מיטוכונדריאלי (MCU), חלבון טרנספורטר יון ונותק מיטוכונדריאלי ממברנה פנימית, מווסת זרם של יונים של סידן לתוך המיטוכונדריה. 4 , 5 , 6 מעכבי כימי של לפשעים חמורים הם כלי רב ערך עבור המשך המאמצים לחקור את תפקוד ואת תפקידי הסלולר לשנע חלבון וסידן מיטוכונדריאלי הזה. מתחם [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, הוא אחד מעכבי סלקטיבי ידוע רק עבור לפשעים חמורים עם ערךד K המדווחת של 24 מיקרומטר.7 ,8,9,10 מתחם זה ממוקם הטומאה נפוצה מצאו ניסוחים מסחרי של רותניום אדום (RuRed), di triruthenium-ממוצע-אוקסו לגשר hexacation של הנוסחה [(NH3) 5 (ממוצע-O) Ru Ru (NH3)4(ממוצע-O) Ru (NH3)5)]6 +, אשר שימש גם בתור מעכב ספיגת סידן. למרות Ru360 זמין מסחרית, זה מאוד יקר. יתר על כן, סינתזה של בידוד של Ru360 קוראים תיגר על ידי טיהור קשה נהלים ושיטות אפיון דו-משמעי
לאחרונה דיווחנו הליכים חלופיים כדי לגשת Ru360 אנלוגי, [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2) Cl5. 11 מתחם זה מעכב לפשעים חמורים עם זיקה גבוהה, הדומה Ru360. ב פרוטוקול זה, נתאר שלנו סינתזה היעיל ביותר של מתחם זה, המתחיל [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2. טיהור של המוצר באמצעות שרף קטיונים חומציים מאוד מפורט, יחד עם מלכודות נפוצות עבור הליך זה. אנחנו גם להציג שיטות אפיון והערכת טוהר מורכבים, ניסחו בגישה פשוטה לבדיקת יעילותה על חסימת ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
סידן מיטוכונדריאלי ספיגת מעכב [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2) Cl5 יכול להיות מסונתז מן [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2, ruthenium(III) ידועה החל חומר, כפי שמתואר בהליך זה. הסינתזה של [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 מושגת בקלות עם קושי קלה. לאחר ערבוב RuCl3</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת קורנל. עבודה זו עשוי להשתמש במרכז קורנל עבור חומרים משותפים מכוני מחקר, אשר נתמכים באמצעות תוכנית ה-NSF MRSEC (גרנט DMR-1120296). S.R.N. מאשר תמיכה של ה-NSF בוגר מחקר לאגודה (גרנט DGE – 1650441), ד ר דייב Holowka לקבלת סיוע עם הניסויים סידן. כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של המחברים (s), אינן משקפות בהכרח את הנופים של הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
