Syntes och utvärdering av en rutenium-baserade mitokondriell kalcium upptag-hämmare
Summary
Ett protokoll för syntes, rening och karakterisering av en rutenium-baserade hämmare av mitokondrie kalcium upptag presenteras. Ett förfarande för att utvärdera dess effektivitet i permeabilized däggdjursceller demonstreras.
Abstract
Vi detalj syntes och rening av en mitokondrie kalcium upptag hämmare, [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)]5 +. Optimerad syntesen av denna förening inleds från [Ru (NH3)5Cl] Cl2 i 1 M NH4OH i en sluten behållare, vilket ger en grön lösning. Rening sker med katjon-exchange kromatografi. Denna förening kännetecknas och verifierade för att vara ren av UV-vis- och IR-spektroskopi. Mitokondriell kalcium upptag hämmande egenskaper bedöms i permeabilized HeLa celler av fluorescens-spektroskopi.
Introduction
Mitokondriell kalcium är en viktig regulator för ett antal processer som är kritiska för normal cellfunktion, inklusive energiproduktion och apoptos. 1 , 2 , 3 den mitokondriella kalcium uniporter (MCU), en ion transportör protein som finns på det inre mitokondriella membranet, reglerar inflödet av kalciumjoner i mitokondrierna. 4 , 5 , 6 kemiska hämmare av MCU är värdefulla verktyg fortsatta ansträngningar för att studera funktion och cellulära roller av denna transport protein och mitokondrie kalcium. Den sammansatta [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, är en av de enda kända selektiva hämmare för MCU med rapporterade Kd värdet 24 µM.7 ,8,9,10 detta komplex är en gemensam förorening som finns i kommersiella formuleringar av rutenium röd (RuRed), en triruthenium di-µ-oxo överbryggas hexacation av formeln [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, som har också använts som en hämmare för upptag av kalcium. Även om Ru360 är kommersiellt tillgängliga, är det mycket kostsamt. Dessutom utmanas syntes och isolering av Ru360 av svårt rening förfaranden och metoder för tvetydiga karakterisering.
Vi har nyligen rapporterat alternativa förfaranden för att komma åt en Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 denna förening hämmar MCU med hög affinitet, liknar Ru360. I detta protokoll, kommer vi att beskriva våra mest effektiva syntes av denna förening, som inleds från [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Rening av produkten med starkt sura katjonbytarmassa är detaljerad, tillsammans med vanliga fallgropar för detta förfarande. Vi också presenterar metoder för karakterisering och bedömning av sammansatta renhet och avgränsa en enkel metod för att testa dess effektivitet i att blockera mitokondriell kalcium upptag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mitokondriella kalcium upptag hämmare [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan syntetiseras från [Ru (NH3)5Cl] Cl2, en välkänd ruthenium(III) utgångsmaterial, som beskrivs i proceduren. Syntesen av [Ru (NH3)5Cl] Cl2 uppnås lätt med lite svårighet. Efter omrörning RuCl3 för 16 h i hydrazin återfukta, pH i lösningen bör justeras till ett värde av 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Cornell University. Detta arbete har använt Cornell centrum för material forskning delade faciliteter, som stöds genom programmet NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. erkänner stöd av en NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE – 1650441) och Dr Dave Holowka för hjälp med kalcium experimenten. Någon åsikt, resultaten och slutsatserna eller rekommendationerna uttryckt i detta material är författarnas (s) och återspeglar inte nödvändigtvis åsikter National Science Foundation.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
