Summary
Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.
Abstract
Het gebruik van gepersonaliseerde geneeskunde voor de behandeling van zeldzame monogeen ziekten zoals lysosomale opslag aandoeningen (LSDs) wordt uitgedaagd door de complexe klinische proef ontwerpen, hoge kosten en lage aantallen van de patiënt. Honderden mutant allelen zijn betrokken in de meeste van de LSDs. De ziekten zijn meestal ingedeeld in 2 tot 3 verschillende klinische typen volgens Ernst. Moleculaire karakterisering van het genotype kan bovendien helpen klinische resultaten voorspellen en informeren van de patiëntenzorg. Daarom ontwikkelden we een eenvoudige cel cultuur assay op basis van HEK293H-cellen geïnfecteerd uiten over de mutaties in de ziekte van Fabry en Pompe geïdentificeerd. Een soortgelijke bepaling is onlangs geïntroduceerd als een preklinische testen te identificeren vatbaar mutaties voor farmacologische Chaperone therapie (PCT's) in de ziekte van Fabry. Dit manuscript beschrijft een gewijzigde cel cultuur assay wat mogelijk maakt snelle fenotypische beoordelingvan allèlique varianten in Fabry en Pompe ziekte vast te stellen die in aanmerking komen patiënten voor PCT en kan steun bij de ontwikkeling van nieuwe pharmacochaperones.
Introduction
Er zijn meer dan een dozijn lysosomale opslag aandoeningen (LSDs) gerelateerd aan glycosidase dysfunctie als gevolg van de primaire genmutaties. In Fabry (OMIM #301500) en de ziekte van Pompe (OMIM #232300), meer dan 500 en 200 missense mutaties1,2,3 zijn gemeld, respectievelijk, hetgeen overeenkomt met ongeveer 60% van de totale mutatie graaf. Worden nog talloze nieuwe varianten van de gen geïdentificeerd, waarvan vele hebben onbekende betekenis. Uitgebreide biochemische studies is gebleken dat bepaalde genotypes niet tot een volledige verlies-van-functie van het GLA -gen leiden (OMIM * 300644) in de ziekte van Fabry, veroorzaken maar het bijbehorende enzym te mislukken om te komen tot een thermodynamisch favoriete opvouwbare4 . Dit resulteert in ER retentie en voortijdige degradatie van het anders functionele enzym. Soortgelijke conclusies hebben getrokken in andere LSDs met inbegrip van Pompe ziekte5. Bovendien, moleculaire karakterisering van enzym varianten kan vergemakkelijken klinische interpretatie van de mutaties ten tijde van de diagnose6, suggereert dat LSD progressie een afzonderlijk proces op basis van de aard van de mutatie is. De traditionele indeling in meestal 2 tot 3 verschillende klinische typen moet dus opnieuw worden beoordeeld om te stroomlijnen klinische counseling en therapeutische besluiten.
Enzym Replacement Therapy (ERT) is beschikbaar voor beide ziekten. ERT, heeft echter beperkte werkzaamheid in de aangetaste weefsels/organen zoals de hersenen en de skeletspieren. Bovendien, ERT kan uitlokken een immunogene reactie dat gevaar vormt voor de therapeutische voordelen. Farmacologische Chaperones (PC's) zijn een aantrekkelijke behandeling alternatief voor patiënten met zogenaamde responsieve mutaties. PC's dienen als een moleculaire steiger voor juiste eiwitvouwing en stabilisatie waardoor op zijn beurt endoplasmatisch reticulum (ER) retentie en ER-geassocieerde afbraak van het enzym. Bovendien, PC's kunnen oraal worden toegediend en kunnen potentieel te steken van de bloed-hersenbarrière. PCT kan dus een meer haalbare optie is voor de behandeling van patiënten met bepaalde genotypes. Voor een uitgebreide review over de PC-toepassing in de LSDs, verwijzen naar de uitstekende beoordeling door Parenti7.
De ontdekking van honderden ziekte veroorzaakt mutant allelen daagt preklinische drug testen en een eenvoudige, snelle en zeer gestandaardiseerde evaluatie van vatbaar patiënten voor een aanpak van gepersonaliseerde geneeskunde noodzakelijk. Teneinde de schadelijke gevolgen van LSD genmutaties en testen van kandidaat-mutaties te voorspellen vatbaar patiënten voor PCT, was een zeer gestandaardiseerde overmaat expressie systeem in de HEK293H cellen die voor snelle en betrouwbare enzym activiteitsmeting zorgt ontwikkeld. Soortgelijke overmatige expressiesystemen eerder zijn beschreven voor Fabry en Pompe ziekte met COS-78,9,10,11, HeLa cellen12, of HEK29313 ,14,15,16 cellen voor het gen glycosidase.
Zelfs een zeer vergelijkbare methode is gepatenteerd als een "methode om te voorspellen response to Chaperone farmacologische behandeling van ziekten"17 dat de relevantie van een cel aangeeft cultuur systeem dat kan worden geïntegreerd in de klinische praktijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Mutant pcDNA3.1/GLA en pcDNA3.1/GAA constructies
Opmerking: De klonen strategieën voor de GLA en GAA codering sequenties (cds) zijn gerapporteerde eerdere15,18.
- Plaats-geleide mutagenese met behulp van plaats-geleide mutagenese
- Gebruik de verwijzing sequenties NM_000169.2 en NM_000152.4 als sjablonen voor de mutagenese van GLA en GAA genen, respectievelijk. Heb een set van hoge zuiverheid zout gratis inleidingen (25-37-mers) gesynthetiseerd door een commerciële aanbieder, met betekenis en antisense inleidingen waaraan één van de respectieve reeks wijzigingen centraal in hun lengte individueel om de mutatie. Gebruik de gratis primer design tool ter ondersteuning van de primer ontwerp19.
- Gebruik de standaardvoorwaarden voor de reactie-oplossing en PCR voorwaarden voorgeschreven door de fabrikant voor het reactiemengsel.
- Meng 5 µL van 10 x 10 reactie buffer ng van double-stranded sjabloon plasmide DNA (pcDNA3.1/GLA of pcDNA3.1/GAA), 125 ng elke primer, 1 µL van het mengsel verstrekte dNTP, 3 µL van DMSO reagens in een passende hoeveelheid gedeïoniseerd water (laatste reactie volume : 50 ΜL). Ten slotte voeg 2.5 U van DNA-polymerase en meng door het pipetteren omhoog en omlaag. Als een negatieve controle, voorhebben over een neen-primer monster.
- Het gebruik van het volgende programma PCR van het begin: stap 1: 95 ° C gedurende 1 min, stap 2: 95 ° C gedurende 50 s, stap 3: 60 ° C gedurende 50 s, stap 4: 68 ° C gedurende 8 minuten, 18 keer herhaalt u stap 2-4 en stap 5: 68 ° C gedurende 10 minuten.
- Na PCR, voeg 1 µL van de Dpnik restrictie-enzym (10 U/µL) en verder uit te broeden de flacon van de reactie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Transformatie en Screening voor de gewenste kloon
- Transformeren een aliquoot gedeelte van ultracompetent cellen overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik SOC medium (trypton 2% (g/v), gist extract van 0,5% (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, steriliseren bij 121 ° C en voeg vervolgens steriele gefiltreerd oplossingen van MgCl2 en glucose tot eindconcentraties van 10 en 20 mM, respectievelijk) in plaats van de fabrikant medium. Na de ingreep, plaat 250 µL van de mutagenese van het monster op een LB plaat met 100 µg/mL ampicilline en Incubeer bij 37 ° C gedurende 18 uur.
- Verzekeren dat het aantal transformants > 10 en de reactie oplevert ten minste drie keer zo veel koloniën als de neen-primer controle reactie, bijvoorbeeldmet behulp van een lichtgevende plaat ter vergemakkelijking van de kolonie tellen. Dan kies 3 kolonies en bereiden 3 mL overnachting culturen in de pond-Bouillon medium.
- De volgende dag, plasmide voorbereiding met een standaard kit uitvoeren en analyseren van de hele reeks met T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) en BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) inleidingen via standaard Sanger sequencing.
- Een geschikte moleculaire biologie-hulpprogramma gebruiken voor het analyseren van de reeks. Wanneer de gewenste mutatie wordt gedetecteerd en geen verdere volgorde van afwijking in vergelijking met NM_000169.2 (α-galactosidase A) of NM_000152.4 (zuur α-glucosidase) is gezien, selecteert u de kloon voor Transfectie-grade plasmide zuivering.
- De zuiverheid van het DNA bepalen door het meten van de extinctie in een spectrofotometer.
Opmerking: Toestaan alleen de voorbereidingen die opleveren van een plasmide zuiverheid met een 260/280 Extinctieverhouding van > 1.8 voor cel cultuur experimenten.
2. teelt van HEK293H cellen
- HEK293H cellen in hoge glucose (4.5 g/L) Dulbecco´s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine handhaven. Houden van de cellen een incubator bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 water-jacket.
- Cultiveren van de cellen met een dichtheid van 80-90%.
- Het medium gecombineerd en wassen na gebruik van fosfaat zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 gebufferde +.
- Passage door het toevoegen van 0,05% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Splits de cellen 1:15 in verse medium en zaad in een nieuwe T75 kolf om de permanente cultuur. Gebruik geen cellen met meer dan 25 passages.
3. pcDNA3.1/GLA en pcDNA3.1/GAA plasmide transfectie en behandeling van HEK293H
- 24 h vóór de transfectie, wassen de cellen van de HEK293H in een maatkolf van T75 cel cultuur een keer met PBS met Ca2 +, Mg2 +. Oogsten van de cellen met 0,05% trypsine-EDTA zoals hierboven aangegeven en zaad 1.5 x 105 cellen in de holten van een plaat van de 24 goed cultuur met behulp van 500 µL DMEM medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica.
- Verrichten van een transfectie protocol volgens de handleiding van de fabrikant. Meestal gebruikt u een mengsel van 1 µg plasmide DNA en 2.5 µL van transfectiereagens in 100 µL van de serum-vrije DMEM. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en toevoegen aan de cellen op een drop-wise wijze daarna.
- Verwijder het medium met de transfectiereagens na een periode van 4 uur op 37 °C/5% CO2 en voeg 500 µL van verse DMEM met 10% FBS / 1% penicilline/streptomycine.
Opmerking: Tijdens deze stap 1-Deoxygalactonojirimycin-Hydrochloride (DGJ) of 1-Deoxynojirimycin-Hydrochloride (DNJ) kan worden toegevoegd aan het kweekmedium indien bestemd (een waterige stockoplossing van 10 mM te gebruiken om een eindconcentratie van 20 µM DGJ en DNJ ). Vers DGJ of DNJ is 42 h toegevoegd na plasmide transfectie.
4. cel oogst en α-galactosidase A of zure α-glucosidase activiteitsmeting
- Oogst van de cel
- Op de dag van de oogst, de cellen verwijderen uit de incubator en gecombineerd van het medium. De cellen 2 keer met PBS met Ca2 + en Mg2 +grondig te wassen.
Opmerking: Deze stap is essentieel omdat DGJ en DNJ krachtige remmers van α-galactosidase en α-glucosidase, respectievelijk zijn, en eventuele overgebleven zou de test ongeldig. - Voeg 200 µL van gedeïoniseerd water rechtstreeks op de top van de cellen. Spoel de cellen van de plaat en deze overbrengen naar een 1,5 mL reactiebuis.
- Op de dag van de oogst, de cellen verwijderen uit de incubator en gecombineerd van het medium. De cellen 2 keer met PBS met Ca2 + en Mg2 +grondig te wassen.
- Homogenisering door bevriezen en ontdooien
- Zet de monsters in een passende schuim rek en vortex voor 5 s de lysis om efficiënter te maken. Zet de monsters die afwisselend in vloeibare stikstof voor 10 s en in een waterbad kamertemperatuur totdat het ontdooien was compleet (5 min).
- Herhaal deze procedure 5 keer en draai vervolgens de monsters gedurende 5 minuten bij 10.000 x g.
- Voorbereiding van een verse buis voor elk monster met 40 µL van gedeïoniseerd H2O en voeg 10 µL van monster. Meng oplossing door vortexing kort en Pipetteer 10 µL in een holte van een 96 goed plaat (elk monster in drievoud). Verdun een 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA)-stockoplossing in gedeïoniseerd H2O als volgt voor het verkrijgen van een standaard curve: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- Start de reactie door toevoeging van 200 µL van BCA reagens (reagens A en B reagens gemengd met een verhouding van 50: 1) en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 37 ° C onder lichte agitatie op een rondschudapparaat (300 rpm). Meet de extinctie op 560 nm in een afleesapparaat.
Opmerking: De monsters bevatten meestal tussen de 1 en 1,5 µg eiwit per µL.
- Verdun het berekende bedrag van elk monster en Pipetteer in verse 1,5 mL reactie buizen 0.05 (voor α-galactosidase A) of 0,5 (voor zure α-glucosidase) µg eiwit/µL om oplossingen te bekomen. Vortex de monsters voor 5 s weer en Pipetteer 10 µL met deze tweevoudige verdunning in een 96 goed plaat (elk monster in tweevoud).
- Start de reactie door 20 µL van de respectieve substraat oplossing toe te voegen:
Voor α-galactosidase A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) in citraat 0.06 M fosfaatbuffer, pH 4.7.
Voor zure α-glucosidase: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) in 0,025 M Natriumacetaat, pH 4.0. - Incubeer de enzym reacties gedurende 1 uur in het donker bij 37 ° C onder lichte agitatie op een rondschudapparaat (300 rpm). Het beëindigen van de reactie door de toevoeging van 200 µL van 1,0 M, pH 10,5 aangepast glycine-NaOH buffer.
- Een standaard curve van 4-methylumbelliferone (4-MU) uit een voorraad van 0,01 mg/mL als volgt voorbereiden:
100 µL H2O / nee 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; geen H2O / 100 µL 4-MU, Pipetteer 10 µL van elke verdunning in de 96 put plaat (in duplicaten) en 200 µL van de 1,0 M glycine-NaOH buffer aan elk putje toevoegen om het aanpassen van het volume en de pH. - Maatregel de enzymactiviteit in een lezer van de fluorescentie uitgerust met het passende filter instellen en analyseren van gegevens met behulp van de juiste software voor het apparaat van de lezer fluorescentie.
Opmerking: Beide 4-mok substraten worden verlaagd tot 4-MU tijdens blootstelling aan α-galactosidase A of zure α-glucosidase. Vrijgegeven 4-MU is een fluorescerende, die kan worden gemeten op 360 en 465 nm als de excitatie en emissie golflengten, respectievelijk, microplate fluorescentie lezer gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De procedure van de mutagenese
Om te beoordelen van de efficiëntie van GLA gene mutagenese, werden de mutaties ingedeeld in één van de volgende categorieën. Deze aanpak voor het genereren van mutaties geopenbaard die ongeveer 66,5% voor de GLA mutaties werden verkregen in de eerste poging. Een verdere 25% kon worden verkregen na een enigszins gewijzigde tweede PCR.
Categorie 1: De mutagenese PCR was effectief bij eerste poging.
Categorie 2: Eerste mutagenese PCR niet (geen kolonies op de plaat, geen ingevoegde mutatie); herhaling met behulp van de dezelfde primer ingesteld doordat de onthardende temperatuur tot 68 ° C was effectief.
Categorie 3: Meer moeite moest worden gedaan om de opbrengst van de gewenste kloon (bijvoorbeeldmeestal een of meer nieuwe reeksen inleidingen werden ontworpen).
Α-galactosidase A en zure α-glucosidase enzym activiteitsmeting
De enzymactiviteit van de verschillende mutant enzymen werd opgenomen na eerdere broedtijd van Transient transfected cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van een PC. Tabel 1 verwijst naar de resultaten voor 3 α-galactosidase A en 3 zuur α-glucosidase mutaties. Gegevens worden weergegeven als absolute waarden (1) voor de omzet van het substraat (nmol 4-MU * mg eiwit-1* h-1) en (2) de relatieve waarden genormaliseerd naar het wild type enzym. Beide uitdrukkingen zijn nuttig, omdat de omzet van de totale substraat illustreert de efficiency van de reactie en de gevoeligheid van het systeem, terwijl de genormaliseerde waarden belangrijke geven kunnen tips voor de waarschijnlijkheid van de maligniteit van de mutatie aan de ene kant en de doelmatigheid van de toegepaste behandeling voor PC aan de andere kant. Voor de experimentele fase, werd de werkstroom afgebeeld in Figuur 1 opgericht, die gepland een incubatietijd van 60 h met de compound (als gevolg van technische redenen, bijvoorbeeld snelle HEK293H celgroei geïntroduceerde voorwaarden). Hoewel er is gezegd dat 10 µM was de geschatte maximale haalbare plasma concentratie voor DGJ14, het huidige protocol gebruikt 20 µM als een redelijke concentratie ten behoeve van een screening voor PC responsiviteit zoals ondersteund door talrijke eerder werkt4,20,21,22,23. Bovendien heeft het is gepostuleerd dat hogere plasma niveaus bereikbaar24.
Figuur 1 : Werken van de stroom van de in vitro meting van de activiteiten van de enzym. (A) de tijdlijn van het experiment toont een 90 h inspanning voor de cultuur van de cel met relatief weinig praktische-op-tijd die nodig is op de aangegeven tijdstippen. (B) vertegenwoordiger plasmide vectoren pcDNA3.1 met wild-type cds van GLA en GAA staan. GLA en GAA wild type plasmiden en plasmiden met inbegrip van de respectieve ingevoegde mutatie van belang werden gebruikt om Transient transfect HEK293H cellen verguld in 24 goed formaat. Na een periode om de cellen te synthetiseren van de respectieve genproducten en voor de verwerking van het enzym, lysosomale vervoer en PC actie, de cellen werden lysed gemeten in een fluorescentie-afleesapparaat en geanalyseerd met behulp van de desbetreffende software. C: cel morfologie en groei status van de HEK293H cellen worden weergegeven in de tijdsverloop van het experiment. Schaal bars = 100 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| in vitro-enzymactiviteit | |||||
| GLA | native | 20 ΜM DGJ | |||
| Mutatie (AA) | nmol 4-mok-gal/mg/h (gemiddelde) | % mean (±SD, N) | nmol 4-mok-gal/mg/h (gemiddelde) | % mean (±SD, N) | betekenis |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8,8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44,2 (±3.6, 5) | **** |
| GAA | native | 20 ΜM DNJ | |||
| Mutatie (AA) | nmol 4-mok-glu/mg/h (gemiddelde) | % mean (±SD, N) | nmol 4-mok-glu/mg/h (gemiddelde) | % mean (±SD, N) | betekenis |
| p.Y455F | 41.1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31,4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65,7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166,5 | 16,7 (±1.5, 5) | ** |
| p.L552P | 0.0 | 0.0 (±. 2, 5) | 104,3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Tabel 1: enzymactiviteit van α-galactosidase A en zure α-glucosidase. De tabel toont representatieve resultaten voor 3 α-galactosidase A en 3 zuur α-glucosidase mutanten met en zonder de PCs DGJ of DNJ. Absolute enzym activiteitsgegevens werd gecorrigeerd voor endogene enzymactiviteit van de cellen van de HEK293H. Om te beoordelen van endogene enzymactiviteit, waren de cellen transfected met een lege vector van pcDNA3.1. De waarden waren 97.5 nmol 4-MU * mg eiwit-1* h-1 voor α-galactosidase A en 41.6 nmol 4-MU * mg eiwit-1* h-1 voor zure α-glucosidase, respectievelijk; enzym activiteit waarden zijn genormaliseerd naar wild type enzym van overeenkomstige experimenten, die verklaart de afwijkingen van relatieve waarden tussen de verschillende mutanten.Na 5 onafhankelijke cel cultuur experimenten (N = 5), elk uitgevoerd in technische duplicaten, dat de standaarddeviatie niet mocht worden > 15% van het gemiddelde. Verhouding T-Tests werden gebruikt voor de berekening van het verschil tussen onbehandeld en PC-behandeld enzym.
* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005, *** p < 0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hierin beschreven levert robuuste resultaten voor de raming van de schade van de enzym in erfelijke Lysosomale ziekten van het metabolisme. Dit manuscript is dat een wijziging van het protocol gepubliceerd eerdere15. De meest cruciale wijzigingen betrekken striktheid (dat wil zeggen, in het proces van voorbereiding van mutant vector construct), standaardisatie van de cel-cultuur-protocol (dat wil zeggen, HEK293H cel onderhoud en transfectie voorwaarden) en de hoge aantal experimentele herhalingen (minstens 5), die sterk tot de reproduceerbaarheid van de resultaten bijgedragen. Over het geheel genomen beide doelgenen zijn gemakkelijk toegankelijk voor de mutagenese en een veelheid van mutaties kan worden gemonteerd in parallel. Een relatief hoge signaal-/ ruisverhouding werd bereikt gezien het feit dat endogene enzymactiviteit binnen de cellen van de HEK293H een te verwaarlozen (α-galactosidase A) voor 1/50 en 1/20 (zure α-glucosidase) van het overdreven uitgedrukt wild type gen was. Er is dus een uitstekende resolutie tussen wild type en mutant enzym. Opgemerkt moet worden dat een ander bedrag van totaal eiwit werd toegepast voor de bepaling van de activiteit van de beide enzymen (0.5 en 5 µg, respectievelijk), omdat het zuur α-glucosidase activiteit was een orde van grootte lager dan die van α-galactosidase A.
Zoals hierboven vermeld, zijn assay parameters vaak controversieel, omdat veel laboratoria hun eigen tests om te onderzoeken lysosomale glycosidases hebben ontwikkeld. De systemen kunnen verschillen in celtype, plasmide-vector design, teelt voorwaarden en drug blootstellingsperiode maar een paar van de talloze parameters te noemen. Een onlangs gepubliceerde meta-analyse voor de ziekte van Fabry aangetoond dat enzym activiteit opnames (met en zonder PC) van transfected cellen modellen (bijvoorbeeld, HEK293, COS-7) was grotendeels overeenkomstig de resultaten van de patiënt-afgeleide cellen) meestal lymfocyten of fibroblasten) ten aanzien van de vraag, of een mutatie is inspelen op de PC24. Eerdere rapporten rechtstreeks vergelijken van patiënt-afgeleide cellen en transfectie modellen aangetoond dat overmatige expressiesystemen de situatie in de cellen van de patiënt weerspiegelen zonder afbreuk te doen aan de conclusie13,14. Derhalve kan worden geconcludeerd dat, ongeacht het specifieke protocol, de resultaten van verschillende auteurs is niet gewijzigd door de verschillende cellulaire systemen, hoewel responder definities uiteenlopende kunnen. De huidige definitie voor een reagerende mutatie is 20% relatieve enzym activiteit verhoging en 5% absoluut enzym activiteit t.o.v. het wild type enzym na incubatie met 20 µM DGJ voor 60 h. Een uitgebreide database, FabryCEP, staat de vergelijking van resultaten die zijn verkregen door verschillende experimentele benaderingen voor honderden α-galactosidase mutanten25.
Of deze criteria toereikend zijn om te voorspellen klinische voordelen van DGJ en DNJ blijft onduidelijk, omdat de mate van activiteit die nodig is ter voorkoming van symptomatische ziekte controversieel is. Een vroegere studie stelde dat 10 tot 15% van de resterende activiteit zou voldoende zijn voor het systeem goed te laten werken26. Echter, in een recent rapport van een fase 2 klinische studie voor DGJ, een verhoging van 1% activiteit werd geacht potentieel nuttig voor de patiënt, toen de basislijn activiteit minder dan 1% van de normale27 was. Recente klinische resultaten suggereren dat patiënten voorspeld inspelen op PC's door responder dedefinitievan ≥20% relatieve stijging en ≥3% absolute stijging van wild type α-galactosidase een activiteit in HEK293H cellen na incubatie met 10 µM DGJ eigenlijk afgeleid klinische voordeel met ziekte stabilisatie of zelfs verbetering door renale en cardiale parameters28. Overwegende dat DGJ is reeds goedgekeurd door de FDA en de EuropeseCommissie als een monotherapie voor ziekte van Fabry, lijkt de loop van PC's zoals DNJ en de afgeleide N-Butyl-DNJ in ziekte van Pompe anders te zijn. Een monotherapeutical benadering met DNJ is beëindigd tijdens een fase II klinische studie als gevolg van ernstige ongewenste voorvallen in sommige van de patiënten-29. PC behandeling in combinatie met goedgekeurde ERT toonde echter een aanzienlijk betere resultaten met betrekking tot ziekte substraat (glycogeen) lager ligt dan de monotherapie ERT30.
Wij stellen voor dat de gepresenteerde aanpak kan worden uitgebreid tot andere LSDs en andere pc's zoals Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff en GM1-gangliosidosis, maar dit niet in specifieke gevallen werken kan, waar bijvoorbeeld de signaal/ruisverhouding van het systeem onvoldoende is. Zorg moet worden genomen om een geschikte cell verstoring, methode voor te bereiden op een cel lysate enzym activiteit vastberadenheid, te selecteren, aangezien de toevoeging van detergentia in de lysis-buffermengsel misschien wel tekenend voor membraan-gebonden enzymen zoals glucocerebrosidase in Ziekte van Gaucher terwijl soortgelijke hoeveelheid wasmiddel schade aan andere enzymen toebrengen kunnen. Voor α-galactosidase A, moet een ultrasoonapparaat gebaseerde cel verstoring methode worden vermeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen van Mandy Loebert en Tina Czajka voor uitstekende technische ondersteuning. Wij danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) voor taal bewerken help.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
