단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법
Summary
이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.
Abstract
고정된 박테리아 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 성적 증명서 개별 메신저 RNA (mRNA)를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH는 성적 증명서의 subcellular 위치 뿐 아니라 관심의 유전자의 mRNA 사본 수에 셀 다양성의 측정을 허용 한다. 주요 단계는 세균성 세포 배양의 고정, 세포 막의 permeabilization 및 상업적으로 사용 가능한 짧은 붙일 레이블 oligonucleotide 조사 세트와 함께 대상 증명서의 교 잡. smFISH는 다른 형광 마커 사이의 스펙트럼 중복에 의해 부과 된 제한 같은 셀에 여러 유전자의 성적 이미지를 허용할 수 있습니다. 아래 설명 하는 프로토콜의 완료, 다음 셀 수 있을 쉽게 몇 군데 낮은 강도의 형광을 위해 적당 한 카메라와 함께 결합 하는 현미경을 사용 하 여. 셀 윤곽선 세분화 단계 대비 프레임, 또는 세포 막 얼룩에서 함께 이러한 이미지 오픈 소스 또는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 샘플의 mRNA 사본 숫자 분포의 계산을 허용 한다. 여기 설명 하는 표기 방법은 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)와 성적 증명서 이미지에 적용할 수 있습니다.
Introduction
Stochasticity는 유전자 발현의 근본적이 고 피할 수 없는 측면 이며 셀 셀이1, 성적 및 단백질2,3의 수준에서 모두 증가 제공 합니다. 잘 정의 된 조건 하에서 세포 사이 가변성을 측정 독특한 창 유전자 발현 및 그것의 규칙의 기반이 되는 기본 프로세스에 제공 합니다. 셀이 박테리아에의 한 중요 한 소스는 transcriptional 수준에서 일어난다. 사본 숫자 규정 등 post-transcriptional 프로세스 뿐만 아니라 전사의 stochasticity 때문에 뿐만 아니라 작은 RNAs 및 RNAases2마다 다릅니다. 양적 패션에서이 성분에 직접 액세스 하는 한 가지 방법은 붙일 smFISH에 주어진된 유전자의 개별 성적표를 태그입니다. 이 방법론 검색 및 특정 RNA 분자의 subcellular 지 방화, 개별 박테리아 세포4고정 수 있습니다. mRNAs는 붙일 표시 된 관심5,6의 성적표에 선택적으로 바인딩할 디자인 된 ~ 20 자료-긴 oligonucleotides의 세트로 때 교배. 여러 라벨 배경 형광, 위에 검출 및 개별 mRNA 분자 형광 현미경7 (참조 그림 1) 회절 제한 된 반점으로 나타납니다. MRNA 분자, 상호 보완적인 올리고 머 프로브 보조 붙일 레이블 기자 기법8을 사용 하 여 검색 된 활용된 haptens (예를 들어, biotin 또는 digoxigenin)를가지고 라벨에 대 한 다른 접근이 있다.
SmFISH 이외에 성적에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하는 다른 방법이 있다. 북부 등 일부 오 점 또는 양이 많은 PCR 일괄 프로브 따라서 mRNA 사본의 수 없으며 개별 셀에서 그들의 위치를 측정할 수 있습니다. 따라서 이러한 방법은 셀 변화 척도를 적합 하지 않습니다. 최근 이미지 기반 기술은 모두 세포 내 RNAs의 복사본 수로 라는 그들의 세포내 위치의 정량화 다중화 오류 강력한 형광 제자리에서 교 잡 (MERFISH)에 대 한 수 있도록 개발 되었습니다. MERFISH 고정된 개수의 붙일 레이블 oligonucleotide 조사에서 정의 된 조합으로 구성 된 고유 바코드의 할당을 기반으로 합니다. 이러한 바코드는 smFISH 측정의 순차적 라운드에서 밖으로 읽힌다, photobleaching와 함께 다음 각 교 잡, 두 배나9,10처리량 증가의. 이 기술은 시스템 및 프로브 세트의 적절 한 디자인 처리는 자동화 된 유체를 필요로 합니다.
해상도에 ten-fold 증가 있습니다 여러 형광 라벨 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)11, 같은 소설 슈퍼 해상도 기술 함께 개별 성적표의의 subcellular 국산화 성적 증명서 폭풍, 형광 프로브 및 이미징 버퍼의 적당 한 조합 당 (깜박이) 프로브 분자 형광 방출의 여러 사이클에 대 한 수 있습니다. 폭풍은 대장균 transcriptome 이미지 및 관심12의 동시에 모든 성적 증명서를 라벨에 의해 RNA의 게놈 넓은 공간 조직 관찰에 사용할 수 있습니다.
위에 검토 하는 모든 단일 셀 방법 고정된 셀에 녹취 록을 이미징 기반으로 합니다. 따라서, 그들은 세포 내에서 성적 운동 속성에 관한 모든 정보를 제공 하지 않습니다. 라이브 셀13에서 성적에 따라, mRNAs 사이트 바인딩 배열에 관심사의 유전자의 융합에 의해 표시 수 있습니다. 이 후자는 다음에 의해 인식 같은 살 균 소 MS2 외 투 단백질, 녹색 형광 단백질 (GFP)10,,1415등 형광 단백질을 융합 한 RNA 의무적인 단백질.
여기는 특히 대장균에 놓여있는지 표시 된 DNA 프로브, smFISH 실험에 사용 하기 위해 집합으로 개별 mRNAs를 라벨에 대 한 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 동일한 라벨 체계 사소한 수정 폭풍 측정을 위해 사용 될 수 있습니다 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 smFISH 방법2를 사용 하 여 대장균 세포에 다른 유전자의 사본 수 우리의 실험실에서 측정 했습니다. 간단히,이 절차는 다음 단계로 구성 됩니다: 셀 고정, 프로브 삽입을 허용 하는 세포 막의 permeabilization 교 잡, 프로브 및 영상 표준 형광 현미경을 사용 하 여 샘플. 이 절차는 일부 수정6,,716게시 했?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 이스라엘 과학 재단 부여 514415 (대표)와 BSF NSF (MCB) 그랜트 2016707 (대표)에 의해 지원 되었다. 지 그 프 리드와 Irma Ullman 교수의 자 (제) 또한 인정에서 지원 합니다.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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