Summary
כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.
Abstract
שיטה מתוארת עבור תיוג RNA שליח בודדים (mRNA) תעתיקים של חיידקים קבוע עבור שימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH מאפשר מדידת השתנות לתא במספר עותק ה-mRNA של הגנים של עניין, כמו גם המיקום subcellular של התרשימים. הצעדים העיקריים הכרוכים הינם קיבוע של התרבות תא החיידק, permeabilization של קרום התא, הכלאה של התרשימים היעד עם קבוצות של הגששים זמינים מסחרית oligonucleotide קצר עם התווית fluorescently. smFISH יכול לאפשר ההדמיה של התרשימים של גנים מרובים באותו התא, עם מגבלות שהוטלו על ידי ספקטרלי החפיפה בין סמנים שונה פלורסנט. בעקבות השלמת פרוטוקול מאויר להלן, תאים יכולים בקלות לדימות באמצעות מיקרוסקופ בשילוב עם מצלמה מתאימה פלורסצנטיות בעוצמה נמוכה. תמונות אלה, יחד עם קווי המתאר תא שהושג פילוח של שלב ניגודיות מסגרות, או קרום התא מכתים, לאפשר את החישוב של mRNA עותק מספר התפלגות דגימה של תאים באמצעות תוכנת קוד פתוח או שכתוב מותאמת אישית. שיטת תיוג המתוארים כאן גם יסייע לי תמונה תעתיקים עם מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה).
Introduction
Stochasticity הוא היבט היסוד, נמנע של ביטוי גנים ונותן עלייה לתא-תא הטרוגניות1, שניהם ברמה של תעתיקים, חלבונים2,3. לכימות ההשתנות בין תאים בתנאים מוגדרים היטב מציעה חלון ייחודי תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס ביטוי ובקרת גנים שלה. מקור חשוב אחד של תא-תא הטרוגניות של חיידקים מתרחש ברמת תעתיק. התעתיק מספרי משתנים לא רק בשל את stochasticity של שעתוק, אלא גם לתהליכים post-transcriptional כגון רגולציה על ידי קטן RNAs ו RNAases2. דרך אחת של גישה ישירה זו הטרוגניות בצורה כמותית היא על-ידי תיוג fluorescently בודדים תעתיקים של גן מסוים ב- smFISH. מתודולוגיה זו מאפשרת זיהוי ולוקליזציה subcellular של מולקולות RNA מסוים בתוך תיקנו, תאים חיידקיים בודדים4. mRNAs הם hybridized עם קבוצה של fluorescently-ידי ~ 20 בסיס באורך oligonucleotides שנועדו לאגד באופן סלקטיבי תעתיקים של ריבית5,6. תיוג מרובים מבטיחה זיהוי מעל רקע זריחה, מולקולות mRNA בודדות מופיעות נקודות עקיפה-מוגבלת תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות7 (ראה איור 1). ישנן גישות אחרות עבור תיוג מולקולות mRNA, שבו הגששים אוליגומר משלימים לשאת haptens מצומדת (למשל, ביוטין או digoxigenin) שזוהו באמצעות טכניקות משני כתב שכותרתו fluorescently8.
ישנן שיטות אחרות המספקים מידע כמותי אודות תעתיקים, בנוסף smFISH. כמה כמו הצפוני כתם או בדיקה הנפח PCR כמותי, ובכך יכול למדוד את מספר העותקים mRNA לא ולא עמדתם בתאים בודדים. לכן שיטות אלה אינם מתאימים לכמת השתנות מתא לתא. המערכת פותחה טכניקה המבוססת על תמונה האחרונות מאפשר כימות של הן מספר עותק RNAs בתוך התאים, כמו גם המיקום תאיים שלהם, שנקרא מרובב פלורסצנטיות שגיאה-חזקה בחיי עיר הכלאה (MERFISH). MERFISH מבוסס על ההקצאה של ברקוד ייחודי המורכב שילוב מוגדר של מספר קבוע של הגששים שכותרתו fluorescently oligonucleotide. ברקודים אלה נקראים סיבובים רציפים של מדידות smFISH, עם photobleaching הבאים בכל סיבוב של הכלאה, ובכך מגדיל את התפוקה על-ידי שני סדרי גודל9,10. טכניקה זו מחייבת של נוזל אוטומטיות טיפול המערכת ואת העיצוב המתאים של ערכת בדיקה.
השילוב של קרינה פלואורסצנטית מרובים תיוג של תעתיקים בודדים, יחד עם טכניקות הרומן סופר-רזולוציה כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)11, מאפשר גידול ten-fold רזולוציה לוקליזציה subcellular של הפרוטוקולים. בסערה, שילוב מתאים של הגששים פלורסנט ומאגר הדמיה מאפשר מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית לכל מולקולה בדיקה (מהבהב). הסערה עשוי לשמש גם תמונה של e. coli transcriptome ולבחון את הגנום כולו הארגון המרחבי של RNA, על-ידי תיוג בו זמנית כל התרשימים של ריבית12.
כל השיטות בתא יחיד שנסקרו לעיל מבוססים על הדמיה תעתיקים בתאים קבוע. לפיכך, הם אינם מספקים מידע כלשהו בדבר המאפיינים קינטי של תעתיקים בתוך התאים. לעקוב תעתיקים תאים חיים13, mRNAs יכול להיקרא על ידי היתוך גרעיני של הגן עניין למערך של איגוד אתרים. ואלו מכן מוכרות על ידי מחייב RNA חלבון, כמו bacteriophage MS2 המעיל חלבון, אשר היא דבוקה חלבון פלואורסצנטי כגון ה14,10,חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)15.
כאן נתאר שיטת תיוג mRNAs בודדים עם סט של הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים smFISH, בפרט ב e. coli. יתר על כן, אנו מראים כי שיטת תיוג אותו עשוי לשמש למדידות סערה עם שינויים מזעריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בדיקה עיצוב
הערה: פרוטוקול זה משתמשת oligonucleotide זמינים מסחרית הגששים כבר מתויג עם fluorophores. הגששים מורכב סט של משלים מטרה ספציפית רצפי mRNA, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת. לחלופין, זה אפשרי לצרף סמני פלורסנט הגששים, כמתואר5,16.
- עיצוב smFISH הגששים באמצעות האלגוריתם16 מעצב בדיקה שפותחה על ידי Raj ארג'ון (ואן Oudenaarden מעבדה, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס); רצפים של הגששים smFISH בשימוש כתב יד זה מפורטים בטבלה של חומרים.
הערה: המספר המינימלי של זונדי בערכת אות לזיהוי זה ~ 30. מספרם המדויק עשויים להשתנות בהתאם הגן של עניין, במיוחד אם תעתיקים קצר מאוד נמדדים. - לבחור צבע שמתאים הגדרת אופטי (ראה טבלה של חומרים).
הערה: לצבוע Cy3 או של צבע שוות ערך שטיחות עם רגישות נמוכה כדי הלבנת-תמונה מומלצת מאוד. מועמד תיוג כפול הוא Cy5 או שוות ערך שטיחות לצבוע (ראה טבלה של חומרים). צבעים מתאימים עבור סערה הדמיה של mRNA שכותרתו מאופיינים שטמונה בהם מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית. קצת צבע smFISH יכול לשמש עבור הדמיה סערה (ראה טבלה של חומרים). לשיקוף תעתיקים שני (או יותר) המתאים גנים שונים באותו התא, אחד צריך לבחור את הגששים oligonucleotide מצומדת כדי צבעי הספקטרום של מי יש חפיפה קטנה או לא.
2. מגיב הכנה
הערה: חשוב לשמור את הדגימות נטולת RNAse באמצעות נטולת RNase מתכלים כגון פיפטה מסוננים טיפים וצינורות, וכדי לשמור בכל סביבת עבודה נקייה. כדי למנוע השפלה של התרשימים היעד, ריאגנטים כל פעם בעקבות קיבוע תא להיות נטול נוקלאז (ראה טבלה של חומרים) או diethylpyrocarbonate (DEPC)- ובא מחוטא.
- מאגרים עבור smFISH
- להכין ללא RNase PBS 1 x (buffered פוספט תמיסת מלח, פתרון עם ריכוז מאגר פוספט של 0.01 M, ריכוז נתרן כלוריד של 0.154 מ', (pH 7.4)). לדלל נטולת RNase PBS 10 x (ראה טבלה של חומרים) ב נוקלאז ללא מים (ראה טבלה של חומרים) ב 1:10 יחס v/v.
- לחילופין להכין שטופלו DEPC 1 x PBS.
- להכין ללא RNase 2 x SSC (תמיסת מלח-נתרן ציטראט מאגר, 0.3 M NaCl ב M 0.03 נקודות סודיום ציטרט, (pH 7.0)). לדלל נטולת RNase 20 x SSC (ראה טבלה של חומרים) במים נטולי נוקלאז בעשר: 1 יחס v/v.
- לחלופין, להכין 2 שטופלו DEPC x SSC.
- להכין ללא RNase PBS 1 x (buffered פוספט תמיסת מלח, פתרון עם ריכוז מאגר פוספט של 0.01 M, ריכוז נתרן כלוריד של 0.154 מ', (pH 7.4)). לדלל נטולת RNase PBS 10 x (ראה טבלה של חומרים) ב נוקלאז ללא מים (ראה טבלה של חומרים) ב 1:10 יחס v/v.
- Oligonucleotide בדיקה מניות פתרון.
- לפזר מחדש את התערובת בדיקה oligonucleotide יבשים ב 200 µL מאגר TE (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) ליצירת מלאי רגש של 25 מיקרומטר. לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז מערבולת, צנטריפוגה בקצרה.
- כדי למנוע את פריזר ואת הפשרה של הצינור פתרון מניות, להפוך מספר aliquots של הפתרון מניות, המתאים הסכום צפוי לשמש ניסיוני יחיד להפעיל. לאחסן את הפתרון מניות ב-20 ° C או להלן, להגן מפני אור.
הערה: ערכה בדיקה של 5 nmol יכול לספק עד 250 ריאקציות הכלאה.
- מאגר הכלאה (בעקבות סקינר. et al. 7 ):
- הוסף 5 מ ל מים נטולי נוקלאז לרכבת התחתית התחתונה חרוט פוליפרופילן 50 מ. להוסיף 1 g של סולפט לתוספי למים, להמיס על-ידי vortexing נמרצת. מערבבים את התוכן שייקר-מסלולית עד בועות נעלמים (~ 30 דקות).
- הוסף µL פתרון 3,530 של formamide יונים, 10 מ ג של e. coli tRNA, 1 מ"ל של 20 x האס, µL 100-200 מ מ vanadyl-ribonucleoside קומפלקס, µL 40 של 50 מ"ג/מ"ל BSA. להביא את עוצמת הקול הסופי 10 מ"ל על ידי תוספת של מים שטופלו DEPC או נוקלאז ללא מים, מערבולת הפתרון עד הוא הומוגני.
הערה: כדי למנוע את פריזר ואת הפשרה של הפתרון, לבצע מספר aliquots של הפתרון מניות, המתאים הסכום צפוי לשמש ניסיוני יחיד להפעיל. חנות הפתרון מניות ב-20 ° C. הקפד לשחרר את formamide חמים לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוק. כדי להפחית את הרקע, הוא הציע כדי לכייל את ריכוז אופטימלי formamide (10-40% יחס v/v).
התראה: אזהרה! Formamide הוא רעיל מאוד, teratogen הידוע של. יש להימנע ממגע עם העיניים או העור, שאיפה או בליעה. . להתמודד עם זה ברדס fume בעת לבישת חלוק מעבדה וכפפות מגן - לחטא את הפתרון על ידי העברתו דרך מסנן 0.22-מיקרומטר. לשמור על aliquots, לאחסן ב-20 ° C עד שנה אחת.
- הכנת מאגר קיבעון (4.6% פורמלדהיד ב- 1 x PBS) על-ידי הוספת 37% פורמלדהיד (v/v) 1 x PBS (ראו 2.1.1) יחס v/v 1:8, מערבולת.
אזהרה: אזהרה! פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, חומר מסרטן ידוע. . להתמודד עם זה ברדס fume בעת לבישת חלוק מעבדה וכפפות מגן - להכין מאגר לשטוף smFISH (20% formamide 2 x SSC) על-ידי הוספת יונים formamide 2 x SSC (ראה 2.1.2) יחס v/v 1:4 ו מערבולת.
- להכין מאגר הדמיה smFISH על-ידי הוספת 5 מ מ cysteamine וחמצן אוכלי נבלות (7 מיקרומטר גלוקוז אוקסידאז, קטלאז nM 56 ו- 10% גלוקוז (w/v)) כדי לשטוף את מאגר (20% formamide 2 x SSC)
- מאגרים עבור סערה
- להכין מאגר על-ידי הוספת 50 מ"מ טריס-HCl 10 מ מ NaCl נוקלאז ללא מים.
הערה: החנות RT במשך שנים. - להכין מאגר B על-ידי הוספת 50 מ מ w/v טריס-HCl, 10 מ מ NaCl ו- 10% גלוקוז ללא נוקלאז למים.
הערה: החנות 4 ° C עד שנה. - להכין מאגר MEA על ידי המסת cysteamine 77 mg ב 1 מ"ל של מאגר A (עושה פתרון 1 מ').
הערה: ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש. - להכין מאגר Gloxy על-ידי הוספת 8,440 AU (יחידות שרירותיות) גלוקוז אוקסידאז, קטלאז AU 70,200 מ ל 1 מאגר א
הערה: גורם 50 x מניות פתרון, ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש. - להכין מאגר הדמיה סערה על-ידי הוספת 50 מ מ של מאגר MEA, 1 x Gloxy מאגר אל מאגר ב'
הערה: המאגר הדמיה סערה מורכב 5 מ מ cysteamine נבלות חמצן (7 מיקרומטר גלוקוז אוקסידאז ו 56 קטלאז ננומטר) ב- 50 מ מ טריס עם 10 מ מ NaCl, גלוקוז 10% ב- pH 8.0. להכין רק לפני הדמיה, יכולים להיות מאוחסנים ב RT המשמש כ 2 h.
- להכין מאגר על-ידי הוספת 50 מ"מ טריס-HCl 10 מ מ NaCl נוקלאז ללא מים.
3. מדגם קיבוע
- לגדל תאים חיידקיים (למשל, אי
הערה: כדי לקבוע את הרקע בשל הכריכה לא ספציפית של הגששים, מידות זן שבו נמחק את הגן עניין וצריך להתנהל, בעקבות אותם הליכים (ראה Δgalk ב איור 1 וδsodB ב איור 2).
הערה: אם המיקרוסקופ שבחרת לא קיים שלב חדות או התערבות דיפרנציאלית חדות יכולות, e. coli ממברנות החיצוני ניתן שכותרתו עם 2 μM סמן פלורסנט lipophilic (ראה טבלה של חומרים), אשר צריך להוסיף ההשעיה חיידקי 20 דקות לפני קיבוע17. קיבוע וטיפול נוסף מוכשרות כמתואר להלן. חייבים להקפיד לבחור סמן פלורסנט יש ספקטרום פליטה שונה, כדי לצמצם את החפיפה ספקטרלי עם ערכת בדיקה עם התווית.
4. מדגם Permeabilization
- הסר בזהירות את תגובת שיקוע. השתמש פיפטות נפח קטן, במידת הצורך להסיר את כל הנוזל החוצה בגדר.
- Resuspend 300 µL שטופלו DEPC במים או נוקלאז ללא מים. מוסיפים 350 µL כיתה גבוהה מוחלטת אתנול (99%) ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך ברכבת התחתית. להוסיף עוד 350 µL של אתנול, מערבבים שוב, כדי להגיע ריכוז האתנול הסופי של 70% (יחס v/v).
אזהרה: אזהרה! אתנול הוא דליק. - לסובב את הדגימה עם שפופרת מסובב ב rpm 20 לשעה בטמפרטורת החדר (RT), או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דוגמאות ניתן לאחסן ב 4 ° C כשבוע.
5. הכלאה
- צניפה תאים על ידי צנטריפוגה 7 דקות, 750 גרם x, 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
- להוסיף 1 מ"ל 20% לשטוף את המאגר כדי הדגימות ולהשאיר במשך מספר דקות או פיפטה להתמוסס בגדר לחלוטין.
- צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות, ב- 750 x גרם, 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את תגובת שיקוע בעדינות על ידי pipetting. השתמש פיפטות בנפח מצומצם במידת הצורך להסיר את כל הנוזל החוצה בגדר.
- להוסיף החללית oligonucleotide הגדר פתרון מניות aliquot מאגר הכלאה כך הריכוז oligonucleotide הסופי הוא 250 ננומטר; מערבולת נמרצות.
הערה: אחד יכול תווית mRNAs מטרה שונים שניים או יותר בו זמנית באותו התא. להוסיף ערכות בדיקה של שתי מטרות המאגר הכלאה. חייבים להקפיד לבחור צבעי שיש ספקטרום הפליטה שונים כדי לצמצם את החפיפה ספקטרלי (למשל, Cy3 ו- Cy5). ודא כי דגימות מיועד סערה הדמיה הן hybridized עם בדיקה oligonucleotide להגדיר מצומדת עם צבע מתאים עבור סערה (למשל, בטבלה של חומרים). - להשעות דגימות (ראה שלב 5.4) 50 µL הכלאה מאגר המכיל את הגששים oligonucleotide, תוך הימנעות את הדור של בועות (הפתרון הוא צמיגה למדי).
- יוצאים דגימות בן לילה על בלוק חם ב 30 מעלות צלזיוס בחושך.
הערה: בעקבות זאת, דגימות ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב 4 º C.
6. כביסה
- להשתמש שפופרת אחת microcentrifuge חדש עבור כל דגימה על תמונות. להוסיף 1 מ"ל שטיפת מאגר.
- להוסיף 10-15 µL בין דגימות hybridized הצינור החדש מכיל את מאגר לשטוף ואת תערובת/מערבולת.
- צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות, 750 גרם x-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
הערה: כדי לצמצם את הרקע, תקופת דגירה של 1 h ב- 30 ° C. - לשטוף פעמיים נוספות (resuspend במאגר שטיפת 1 מ"ל, צנטריפוגה ולהסיר גלולה).
- Resuspend במאגר לשטוף µL 25.
הערה: על מנת להפחית הלבנת-תמונה אחת ניתן להוסיף המאגר שטיפת חמצן ניקוי מערכת (2.6) כדי לשפר את יציבות צבען מולקולה בודדת פלורסצנטיות ניסויים6.
7. הכנת דוגמאות עבור הדמיה
הערה: תאים צריך להיות מרותק למיטה על מנת לאפשר הדמיה תקין תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות, שלב-ניגודיות. ניתן להשתמש בשיטות הבאות כדי להכין דוגמאות שבו השדות מבט שונות יכול לדימות-מטוסים מוקד שונים.
- הכנת ג'ל Agarose
- להוסיף 150 מ"ג agarose למאגר x SSC 10 מ ל 2. אל תוסיף 2 x SSC כדי agarose, אחרת זה לא יתמוסס כראוי.
- מיקרוגל עבור s 10-15 בכל פעם עד בועות גדולות מתחילים להיווצר. להפריש להתקרר כמה דקות.
- המקום מסגרת סיליקון הפרדת בשקופית כך המרכז של השקופית נשאר חשוף.
- במקום טבעת נוקשה 10 מ מ רחב (1-2 מ מ עובי) במרכז השקופית, להפקיד כמות קטנה של ג'ל בו עבור איטום. המתן מספר דקות בשביל זה להקשיח.
- הוסף ג'ל נוסף עד נוצרת צורת כיפה גבוהה. חכה 10 דקות בשביל זה להקשיח, ולהסיר את הטבעת (באמצעות פינצטה בסדר או כל שיטה אחרת).
- להפקיד ~ 10 μL של שטף תאים חיידקיים (ראה 6.5) על ג'ל, חותם עם מגלשת coverslip #0.
- הכנת הדוגמא קאמרית עבור smFISH
- לחילופין (לשלב 7.1) הכין דוגמיות הדמיה על ידי שיתק את שטף תאים חיידקיים (ראה 6.5) על פולי-D-ליזין-מצופה זכוכית תחתון חד פעמיות מפלסטיק צלחות פטרי.
- דגירה בדגימות בחושך, בטמפרטורת החדר, בין לילה לפני להדמיה כדי לאפשר הדבקה של תאי השטח. לפני ויזואליזציה לשטוף פעם עם שטיפת מאגר (. 5); שמור את הדגימה רטוב עם שטיפת מאגר buffer(2.5) או הדמיה עבור smFISH (2.6).
- תא הדגימה לקראת סופה
- להכין דגימות סערה עבור הדמיה על פולי-D-ליזין-מצופה זכוכית תחתון חד פעמיות מפלסטיק צלחות פטרי.
- דגירה בדגימות בחושך, ב RT, בן לילה. לפני ויזואליזציה לשטוף פעם עם שטיפת המאגר עבור smFISH (2.5); ולהוסיף מאגר הדמיה עבור סערה (2.7.5).
8.התעתיק ויזואליזציה
- תמונה תאים עם מיקרוסקופ שדה רחב פלורסצנטיות מצויד שלב ממונע (ראה טבלה של חומרים).
הערה: עבור השינוי סערה, השתמש תאים עם תוויות עם צבע מסוגל מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית. תמונת מדגם באמצעות מערכת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה סופר (למשל, עיין בטבלה של חומרים). - שימוש (מומלץ) 60-100 x N.A > 1.3 שמן טבילה שלב ניגודיות המטרה עדשה עם מקור אור חזק, כגון כספית או מטאל-הליד; מקורות אור מבוססי LED גם הם מומלצים.
- שימוש רגיל מקורר מצלמת CCD, אידיאלי אופטימיזציה עבור הדמיה ברמה נמוכה-אור יותר מאשר מהירות (אנו משתמשים מצלמה עם 16 גודל פיקסלים מיקרומטר) (ראה טבלה של חומרים).
הערה: השימוש של EMCCD מקורר (אלקטרון הכפלת חיוב מצמידים התקן) מצלמה CCD מצלמה יש צורך להפחית את הרעש תרמית המונעת זיהוי, במיוחד של מולקולות יחיד. - שימוש במסנן מגדיר מתאים fluorophores שבחרת.
- כדי לקבוע כראוי תא לגבולות התא, לרכוש תמונות של שדות מבט שונות בכל מדגם עם אופטיקה חדות שלב, או על-ידי תיוג fluorescently קרום התא החיצוני. לרכוש תמונות-מטוסים מוקד שונים (z-מחסנית) עבור כל הערוצים (בדרך כלל הפרוסות 13 מופרדים 250 ננומטר נלקחים).
הערה: השלב ממונע של המיקרוסקופ, מערכות סינון של צריכה להיות נשלטת על ידי מסחרי (ראה טבלה של חומרים) או תוכנה שבאתר ניתן ללכוד ערימה של תמונות ברצף.
9. ניתוח נתונים
- להמיר את אוספי תמונות לתבנית מתאימה לניתוח נתונים.
- להעריך את עותק מספר היעד mRNA בעצימות הכולל של מוקדים פלורסנט בתא, ולא סופר דיסקרטית 'כתמים' כמו פרוטוקולים אחרים הזמינים כרגע.
- לבצע ניתוח תמונות עם תוכנת קוד פתוח18 או עם תוכנית לפי הזמנה. לפרטים על נתונים הדמיה וניתוח ראו סקינר. et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו ביצעו smFISH מדידות של הפרוטוקולים galK ו- sodB בתאים e. coli . התמלילים היו hybridized עם סט של רצפים ספציפיים משלים הרצף היעד, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת (ראה טבלה של חומרים). קרינה פלואורסצנטית ושלב חדות תמונות של MG1655 פראי-סוג e. coli זן (WT) או JW0740 (אוסף קאיו)19 שנמחקו galK זן (ΔgalK) נחשפו 2 מ מ D-fucose מוצגות באיור איור 1A ו- 1B. התאים היו קבוע לפחות 3 שעות לאחר חשיפה D-fucose. הלוחות ב איור 1A (למעלה) הצג מסגרת אחת מתוך 13, המתאים לגובה שבו הם קווי המתאר תא בפוקוס, המייצג את רמת האינדוקציה galK בתגובה משתנה ריכוז D-fucose חוץ-תאית. כתמים בתוך התאים של תמונות פלורסצנטיות שיתאימו גם galk יחיד או כמה תעתיקים, הקביעה של המספר התעתיק בכל תא מבוצע על ידי לכימות פלורסצנטיות לשפות אחרות. כתמים רבים נראים רוב התאים, כאשר 2 מ מ D-fucose נוספת התרבות חיידקי, בעוד כמה נקודות נראים בהיעדרו של D-fucose חוץ-תאית. בנימהgalK Δ. אין כתמים שנצפו ברקע כמו הצפויה. משטח תיוג עם סמן פלורסנט lipophilic מוצג איור 1B (למטה).
בנוסף, אנחנו צילמו את התמלילים sodB בתרבות חיידקי e. coli גדל במדיום LB בשלב הצמיחה לוגריתמי. קרינה פלואורסצנטית ותמונות חדות שלב של smFISH ב WT או JW1648 (אוסף קאיו)19 שנמחקו sodB זן (ΔsodB) מוצגים באיור 2A. הלוחות ב 2A איור (למעלה) הצג מסגרת אחת מתוך 13, המתאים לגובה באיזה תא קווי המתאר הן בפוקוס, המייצג את רמת sodB. בנימה זוsodB Δ, אין כתמים שנצפו ברקע, כמו הצפויה.
התרבויות אותו היו עם תמונה בסערה (למעלה), היקפה של התאים היו נחושים עם משטח תיוג באמצעות סמן פלורסנט lipophilic להמחשת הלוקליזציה של sodB בתוך התאים. מכתים את הקרום מאפשר מיקום מדויק של הפרוטוקולים בתא (איור 2B). המתחsodB Δ נלקח כאות רקע וכדי לקבוע את גודל האשכול מינימלי (ראה איור 2B). התעתיק רשע מספר smFISH2 ו הסערה הוא דומה.
איור 1: ההשפעות של D-fucose על galK תעתיקים visualized באמצעות smFISH. (א) למעלה: smFISH תמונות של זריחה של galK ה-mRNA של הפרט e. coli תאים. זן פראי-סוג MG1655 (WT) או JW0740 (אוסף קאיו) galK -נמחק זן (ΔgalK)19 היו בוגרים עם או בלי 2 מ מ D-fucose. התרשימים galK היו hybridized על הגששים משלימים מצומדת עם צבע שטיחות שקול ל- Cy3 (ראה טבלה של חומרים). למטה: באותו שדות ראייה בחדות-שלב. (B) WT התאים גדלו עם או בלי 2 מ מ D-fucose לעיל, שכותרתו עם 2 μM של קרום lipophilic לצבוע (ראה טבלה של חומרים) כעשרים דקות לפני קיבוע. העליון: זריחה תמונות של galK mRNA באמצעות smFISH. התמונות צולמו עם מיקרוסקופ נשלט על ידי תוכנה מסחרית באמצעות 100 × N.A 1.45 שמן טבילה שלב חדות העדשה אובייקטיבי (ראה טבלה של חומרים), מצלמה EMCCD (ראה טבלה של חומרים). המסננים המשמשים היו כפי שמתואר בטבלה של חומרים. תמונת שלב ניגודיות נרכשה ואחריו z-בערימה של פרוסות 13 ו 250 ננומטר המרווח של תמונות פלורסנט עם 2 s שילוב זמן כל פרוסה. התיכון: באותו שדות ראייה עם ניגודיות שלב ההדמיה. למטה: תאים עם סמנים פלורסנט lipophilic, תוויות עם מסננים המתאימה המתוארת בטבלה חומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הדמיה של sodB תעתיקים המסומנת המכשיר באותו הגדר smFISH, סטורם. (א) למעלה: smFISH תמונות של זריחה של sodB ה-mRNA של הפרט e. coli תאים. זן פראי-סוג MG1655 (WT) או JW1648 (אוסף קאיו) sodB -נמחק זן (ΔsodB)19 גדלו במדיום ליברות. התרשימים sodB היו hybridized על הגששים משלימים מצומדת עם צבע שטיחות שקול ל- Cy5 (ראה טבלה של חומרים). למטה: באותו שדות ראייה בחדות-שלב. שכבת-על (B) של מולקולות פלורסנט (נקודות צבעוניות בודדים) לשפות אחרות בסערה (670 nm פליטה), תצלום בזק של קרום התא בתוך שדה הראייה אותו. התאים הודבקו תוויות עם צבע lipophilic, מתלהבים עם לייזר ארגון-488 nm ב 1% של כוח מקסימלי (0.05 kW/cm2) עם שיא פליטה-510 ננומטר, עם תמונה עם המתאים לסנן (ראה טבלה של חומרים). תאים WT ו sodB היו מבוגרים כפי שתואר לעיל, שכותרתו עם 2 ממברנה lipophilic μM לצבוע (ראה טבלה של חומרים) כעשרים דקות לפני קיבוע. תמונות ברזולוציה סופר נרשמו עם מיקרוסקופ המסחרי (ראה טבלה של חומרים). תעתיקים בלוחיות צבע שטיחות מקביל Cy5 נרשמו נקודתית באמצעות לייזר עירור ב 647 nm, מאגר הדמיה עבור סערה. תמונות נרשמו באמצעות a 60 x, נה 1.2 מים טבילה אובייקטיבי (ראה טבלה של חומרים), מצלמה EMCCD (ראה טבלה של חומרים) עם רווח שוכן בגובה 50, מסגרת שיעור 50 הרץ, ואת כוח מקסימלי של לייזרים nm ב 5 ו 0.05 kW/cm2 647, 405 , בהתאמה. המספר הכולל של מסגרות רכשה היה 8,000. הנתונים היה מנותח באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לנו יש למדוד במעבדה שלנו המספר תעתיק של גנים שונים ב e. coli תאים באמצעות שיטת smFISH2. בקצרה, ההליך מורכב מהשלבים הבאים: תא קיבעון, permeabilization של ממברנות כדי לאפשר חדירה בדיקה, בדיקה הכלאה, וטעמו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה. נוהל זה מבוסס על אלה שפורסמו בעבר עם כמה שינויים6,7,16. קודם לכן דווח ש-smfish הזה דורש מספר oligonucleotide הגששים לשקר בטווח של 48-72, על מנת להשיג אות שוכב מעל הרקע7. אנחנו הראו כי מספר זה עשוי להיות למעשה קטן יותר20, בהתאם רצף גנטי של הריבית, הגדרת אופטי ניסיוני התנאים הספציפיים.
כל רכב הגישוש אמור להיות ארוך, עם ההפרדה בין בדיקה לפחות שני 17-22 נוקלאוטידים נוקלאוטידים ותוכן GC של ~ 45%, על מנת להפחית את השפעות שאינם ספציפיים, את המטרה מחייב. הגששים מסוימים עלולים להיכשל לאגד מטרה, ניתן למטב את היעילות הכוללת של הכריכה על ידי שינויים של ניסיוני במחטים התנאים של קיבעון, הכלאה21. גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא הבחירה של fluorophores. מומלץ מאוד לסמן את הגששים עם צבע עם רגישות נמוכה הלבנת-צילום. הלבנת-צילום וצמצום יכולה להיות מושגת על ידי אופטימיזציה של פעמים חשיפה, מקורות תאורה ושעות שילוב של ייבוא תמונות, ועל ידי התוספת של חמצן ניקוי המערכת.
וצריך להעריך את מידת אירועים שאינם ספציפיים מחייב על-ידי ביצוע ניסויים smFISH עם תאים זנים של המטרה אילו גנים נמחקו, לדוגמה אוסף קאיו19. אם האות רקע גבוה, המספר ואת משך של שוטף צעדים צריך להיות מוגברת, או תאים צריך להיות מודגרות במאגר שטיפת ב 30 ° C עבור 1 h, ואז לשטוף פעמיים. יתר על כן, כדי להפחית את הרקע, הוא הציע כדי למטב את ריכוז formamide (10-40% יחס v/v) הכלאה, המאגרים לשטוף. הגדלת ריכוז formamide מפחיתה איגוד לא ספציפית, אך ייתכן שתצמצם את הכריכה של הגששים יעד ה-mRNA. במהלך השלב הכלאה, חשוב להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין; מאגר שתדללו הכלאה עשויה להוביל ירד תיוג יעילות. בנוסף, המטרה RNAs חייבת להיות ארוכה דיה על מנת לקבל מקום מותאם היטב מעל הרקע. השיפורים האחרונים אות לרעש יחסי ולא מחייב ירידה לפרטים דרך שינוי עמוד השדרה של הגששים עכשיו לעשות זה אפשרי לגילוי RNA קצרים יותר שברים, כגון מיקרו Rna האיקריוטים או חיידקי קטן ללא קידוד RNAs2, 10. אנו ממליצים כי המספר אומר עותק מתקבל על ידי smFISH לאמת עם ה-PCR כמותי7,16.
אנחנו הראו כתב יד זה כי בשיטה זו ניתן לשנות עם שינויים קלים ללמוד הלוקליזציה של תעתיקים ב e. coli עם רזולוציה אופטית גבוהה יותר באמצעות שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)11.
לסיכום, smFISH היא שיטה רב-תכליתי לתאורת RNA המאפשר של מדידה ישירה של ההשתנות תא-תא במספר התעתיק הלוקליזציה של היעד תעתיקים בתא, פרוקריוטים והן אאוקריוטים. הוא מספק מידע כמותי אודות תהליכים בסיסיים של ביטוי גנים, ניתן להגיע בקלות מיושם עבור הדמיה סערה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדעים 514415 (ל. י. ס) ו- BSF-NSF (MCB) מענק 2016707 (ס). תומך זיגפריד, אירמה אולמן הלימודית הכסא (ס) הוא גם הודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S.
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
