सीटू संकरण प्रयोगों में एकल-अणु प्रतिदीप्ति के लिए व्यक्तिगत ई कोलाई कोशिकाओं में लेबलिंग टेप के लिए विधि
Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन व्यक्तिगत दूत आरएनए (mRNA) टेप के साथ फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए जांच के लिए एक विधि, एकल में उपयोग के लिए अणु प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (smFISH) प्रयोगों में ई. कोलाई. smFISH एक दृश्य विधि है कि एक साथ का पता लगाने, स्थानीयकरण, और स्थिर व्यक्तिगत कोशिकाओं में एकल mRNA अणुओं के ठहराव की अनुमति देता है ।
Abstract
एक विधि एक व्यक्ति दूत आरएनए (mRNA) में एक अणु प्रतिदीप्ति में प्रयोग के लिए फिक्स्ड बैक्टीरिया में टेप लेबलिंग के लिए वर्णित है सीटू संकरण में (smFISH) प्रयोगों में ई. कोलाई. smFISH ब्याज की जीन की mRNA कॉपी संख्या में सेल के लिए सेल परिवर्तनशीलता की माप, साथ ही टेप के सेलुलर स्थान की अनुमति देता है । मुख्य शामिल कदम बैक्टीरियल कोशिका संस्कृति के निर्धारण, सेल झिल्ली के permeabilization, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लघु फ्लोरोसेंट के सेट के साथ लक्ष्य टेप के संकरण-लेबल oligonucleotide जांच कर रहे हैं । smFISH अलग फ्लोरोसेंट मार्करों के बीच वर्णक्रम ओवरलैप द्वारा लगाया सीमाओं के साथ, एक ही सेल में कई जीनों की टेप के इमेजिंग की अनुमति दे सकते हैं. नीचे सचित्र प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद, कोशिकाओं को आसानी से एक कम तीव्रता प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त कैमरा के साथ युग्मित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि हो सकता है । इन छवियों, एक साथ सेल के दौर के विपरीत फ्रेम के विभाजन से प्राप्त की आकृति के साथ, या सेल झिल्ली धुंधला से, खुले स्रोत या कस्टम-लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोशिकाओं के एक नमूने के mRNA कॉपी संख्या वितरण की गणना की अनुमति । लेबलिंग विधि यहां भी stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के साथ छवि टेप करने के लिए लागू किया जा सकता है वर्णित है ।
Introduction
Stochasticity जीन अभिव्यक्ति का एक मौलिक और अपरिहार्य पहलू है और2,3टेप और प्रोटीन के स्तर पर सेल-सेल विविधता1को जंम देता है । अच्छी तरह से परिभाषित शर्तों के तहत कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता को बढ़ाता बुनियादी प्रक्रियाओं है कि आबाद जीन अभिव्यक्ति और उसके विनियमन में एक अनोखी खिड़की प्रदान करता है । कोशिका कोशिका विविधता बैक्टीरिया में एक महत्वपूर्ण स्रोत transcriptional स्तर पर जगह लेता है । प्रतिलिपि संख्या न केवल प्रतिलेखन के stochasticity के कारण भिंन है, लेकिन यह भी पोस्ट करने के लिए जैसे छोटे RNAs और RNAases द्वारा विनियमन के रूप में transcriptional प्रक्रियाओं2। सीधे एक मात्रात्मक फैशन में इस विविधता तक पहुंचने का एक तरीका है फ्लोरोसेंट द्वारा smFISH में दिए गए जीन के व्यक्तिगत टेप टैगिंग । इस पद्धति का पता लगाने और निश्चित, व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं को4में विशेष रूप से आरएनए अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण की अनुमति देता है । mRNAs फ्लोरोसेंट का एक सेट के साथ संकर-लेबल ~ 20 आधार लंबी oligonucleotides है कि चुनिंदा के लिए ब्याज के टेप को बांध डिजाइन किए है5,6। एकाधिक लेबलिंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के ऊपर का पता लगाने सुनिश्चित करता है, और व्यक्तिगत mRNA अणुओं एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत विवर्तन-सीमित स्थानों के रूप में दिखाई देते हैं7 (देखें चित्रा 1). वहां mRNA अणुओं लेबलिंग के लिए अंय दृष्टिकोण हैं, जिसमें पूरक oligomer जांच संयुग्मित haptens ले (जैसे, बायोटिन या digoxigenin) कि माध्यमिक फ्लोरोसेंट लेबल रिपोर्टर तकनीक8का उपयोग कर पता लगाया है ।
वहां अंय तरीकों कि टेप के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर रहे हैं, smFISH के अलावा । कुछ, जैसे उत्तरी दाग या मात्रात्मक पीसीआर, जांच थोक और इस तरह के mRNA प्रतियां की संख्या न तो माप सकते है और न ही व्यक्तिगत कोशिकाओं में अपनी स्थिति । इसलिए इन तरीकों कोशिका के लिए सेल परिवर्तनशीलता यों तो उपयुक्त नहीं हैं । हाल ही में एक छवि आधारित तकनीक है कि कोशिकाओं के भीतर RNAs की प्रतिलिपि संख्या दोनों के ठहराव के लिए अनुमति देता है और साथ ही उनके intracellular स्थान, बुलाया मल्टीप्लेक्स त्रुटि-मजबूत प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (MERFISH) विकसित किया गया है । MERFISH फ्लोरोसेंट-लेबल oligonucleotide जांच की एक निश्चित संख्या से एक परिभाषित संयोजन से मिलकर एक अनूठा बारकोड के काम पर आधारित है । इन बारकोड smFISH माप के अनुक्रमिक दौर में बाहर पढ़ रहे हैं, संकरण के प्रत्येक दौर के बाद photobleaching के साथ, जिससे परिमाण9,10के दो आदेश से प्रवाह में वृद्धि । इस तकनीक आवश्यक एक स्वचालित द्रव हैंडलिंग प्रणाली और जांच सेट के उचित डिजाइन ।
व्यक्तिगत टेप के एकाधिक प्रतिदीप्ति लेबलिंग के संयोजन, एक साथ उपंयास सुपर संकल्प तकनीकों जैसे stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान)11के साथ, में संकल्प में एक दस गुना वृद्धि सक्षम बनाता है टेप का उपसेलुलर स्थानीयकरण । तूफान में, फ्लोरोसेंट जांच और इमेजिंग बफर का एक उपयुक्त संयोजन जांच अणु (निमिष) प्रति प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के कई चक्र के लिए अनुमति देता है । तूफान भी ई. कोलाई transcriptome छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक साथ सभी ब्याज की सभी टेप लेबलिंग द्वारा, आरएनए के जीनोम व्यापक स्थानिक संगठन का निरीक्षण12।
सभी एकल कोशिका के ऊपर की समीक्षा की विधि निश्चित कोशिकाओं में इमेजिंग टेप पर आधारित हैं । इसलिए, वे किसी भी सेल के भीतर टेप के काइनेटिक गुण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । जीवित कोशिकाओं में टेप का पालन करें13, mRNAs बंधन साइटों की एक सरणी के लिए ब्याज की जीन के फ्यूजन द्वारा लेबल किया जा सकता है । इन बाद तो एक आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं, ऐसे भोजी MS2 कोट प्रोटीन के रूप में, जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए है जैसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)10,14,15।
यहां हम फ्लोरोसेंट-लेबल डीएनए जांच का एक सेट के साथ व्यक्तिगत mRNAs लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन, smFISH प्रयोगों में विशेष रूप से ई. कोलाईमें उपयोग के लिए । इसके अलावा, हम बताते है कि एक ही लेबलिंग योजना मामूली संशोधनों के साथ तूफान माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम अपनी प्रयोगशाला में smFISH विधि2का उपयोग कर ई. कोलाई कोशिकाओं में अलग जीन की प्रतिलिपि संख्या मापा है । संक्षेप में, इस प्रक्रिया में निंनलिखित कदम होते हैं: कोशिका निर्धारण, झिल्ली की permeabilization …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक इसराइल विज्ञान फाउंडेशन अनुदान ५१४४१५ (जे) और एक बीएसएफ-NSF (म्क्ब) अनुदान २०१६७०७ (जे करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था । एक Siegfried और जेनिंग्स Ullman प्रोफेसरी कुर्सी (जे) से समर्थन भी स्वीकार किया है ।
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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