Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação
Summary
Este manuscrito descreve um método para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcrições com fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH é um método de visualização que permite a deteção simultânea, localização e quantificação de simples moléculas de mRNA em células individuais fixas.
Abstract
Um método é descrito para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcritos em bactérias fixas para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH permite a medição de célula para célula variabilidade no número de cópia de mRNA de genes de interesse, bem como a Localização subcellular de transcrições. As principais etapas envolvidas são a fixação da cultura de pilha bacteriana, permeabilização de membranas celulares e a hibridação de transcrições o alvo com conjuntos de sondas comercialmente disponível do oligonucleotide fluorescente-etiquetadas curto. smFISH pode permitir que a imagem da transcrição de genes múltiplos na mesma cela, com limitações impostas pela sobreposição espectral entre diferentes marcadores fluorescentes. Após a conclusão do protocolo ilustrado abaixo, células podem ser prontamente fotografadas usando um microscópio acoplado com uma câmera apropriada para fluorescência de baixa intensidade. Estas imagens, juntamente com contornos de células obtidas a partir de segmentação de quadros de contraste de fase ou coloração de membrana celular, permitem o cálculo da distribuição número da cópia do mRNA de uma amostra de células usando o software de código-fonte aberto ou personalizada. O método de rotulagem descrito aqui também pode ser aplicado a transcrições de imagem com microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade).
Introduction
Sem rumo é um aspecto fundamental e inevitável da expressão genética e dá origem a célula-célula heterogeneidade1, tanto a nível de proteínas e transcrições de2,3. Quantificar a variabilidade entre as células sob condições bem definidas oferece uma única janela para os processos básicos que fundamentam a expressão dos genes e sua regulação. Uma importante fonte de heterogeneidade celular em bactérias ocorre no nível transcricional. Transcrição de números variam não apenas devido o crescimento da transcrição, mas também para processos pós-transcricional como regulamento por pequenos RNAs e RNAases2. Uma maneira de acessar diretamente esta heterogeneidade de forma quantitativa é por marcação fluorescente transcrições individuais de um determinado gene em smFISH. Esta metodologia permite a detecção e Localização subcellular de moléculas de RNA específicas no fixo, as células bacterianas individuais4. mRNAs são cruzados com um conjunto de fluorescente-etiquetadas ~ 20 base-long oligonucleotides que são projetados para ligar-se selectivamente para transcrições de interesse5,6. Múltiplas rotulagem garante deteção acima da fluorescência do fundo, e moléculas de mRNA individuais aparecem como manchas de difração limitada sob um microscópio de fluorescência7 (Ver Figura 1). Existem outras abordagens para a rotulagem de moléculas de mRNA, em que as sondas complementares oligómero carregam haptens conjugados (por exemplo, biotina ou Digoxigenina) que são detectados usando secundário fluorescente-etiquetadas repórter técnicas8.
Existem outros métodos que fornecem informações quantitativas sobre as transcrições, além de smFISH. Alguns, como a Northern blot ou PCR quantitativo, a maior parte da ponta de prova e, portanto, pode medir o número de cópias do mRNA, nem sua posição em células individuais. Portanto, esses métodos não são adequados para quantificar a variabilidade de célula para célula. Desenvolveu uma técnica baseada em imagem recente que permite a quantificação de tanto o número de cópia de RNAs dentro das células, bem como sua localização intracelular, chamado multiplexado fluorescência erro-robusto em situ da hibridação (MERFISH). MERFISH baseia-se na atribuição de um código de barras exclusivo composto por uma combinação definida de um número fixo de pontas de prova do oligonucleotide fluorescente-etiquetadas. Esses códigos de barras são lidos nas rodadas sequenciais das medições de smFISH, com fotobranqueamento seguinte cada rodada de hibridação, aumentando assim a taxa de transferência por duas ordens de magnitude9,10. Esta técnica exige um fluido automatizado, manipulação de sistema e o projeto apropriado do conjunto de sonda.
A combinação de vários fluorescência rotulagem de transcrições individuais, juntamente com técnicas de super-resolução romance como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)11, permite um aumento de dez vezes na resolução na Localização subcellular das transcrições. Na tempestade, uma combinação adequada de sondas fluorescentes e buffer de imagem permite múltiplos ciclos de emissão de fluorescência por molécula de sonda (piscando). TEMPESTADE também pode ser usado para a imagem da transcriptoma de Escherichia coli e observar a organização espacial de todo o genoma de RNA, pela rotulagem simultaneamente todas as transcrições de interesse12.
Todos os métodos de célula única revistos acima baseiam-se na imagem transcritos em células fixas. Portanto, eles não fornecem todas as informações sobre as propriedades cinéticas de transcrições dentro das células. A seguir transcritos em células vivas13, mRNAs podem ser rotulados pela fusão do gene de interesse para uma matriz de binding sites. Estes últimos são então reconhecidos por uma RNA-proteína, tais como o bacteriófago MS2 proteína de casaco, que é fundido a uma proteína fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (GFP)10,14,15.
Aqui nós descrevemos um método para rotular os mRNAs individuais com um conjunto de fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em experimentos de smFISH, em particular em e. coli. Além disso, mostramos que o mesmo esquema de rotulagem pode ser utilizado para as medições de tempestade com pequenas modificações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medimos em nosso laboratório o número de transcrição de diferentes genes em células de Escherichia coli usando o smFISH método2. Em breve, este procedimento consiste das seguintes etapas: fixação da pilha, permeabilização de membranas para permitir a penetração da sonda, sonda de hibridização e amostra de imagem usando um microscópio de fluorescência padrão. Este procedimento baseia-se os publicados anteriormente, com algumas modificações6,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um Israel Science Foundation grant 514415 (J.S.) e uma subvenção de BSF-NSF (MCB) 2016707 (a J.S.). Suporte de Siegfried e Irma Ullman professoral cadeira (J.S.) também é reconhecida.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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