Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 для анализа формирования и ремонт двухнитевые разрывы ДНК
Summary
Эта рукопись обеспечивает протокол для анализа двухнитевые разрывы ДНК, иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.
Abstract
Двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются серьезные повреждения ДНК. Анализ формирования и ремонт DSB актуальна в широком спектре областей исследований, включая целостности генома, генотоксичности, радиационной биологии, старение, рак и разработки лекарственных средств. В ответ на DSB гистон H2AX фосфорилированных 139 Серина в регионе несколько пар megabase, образуя дискретных ядерной очагов обнаружено в иммунофлуоресценции. Кроме того, 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другим важным DSB-отзывчивым белком, поощрение ремонт DSB nonhomologous конце-присоединиться к предотвращая гомологичная рекомбинация. Согласно конкретных функций γH2AX и 53BP1 совокупный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть разумный подход для детального анализа DSB. Эта рукопись предоставляет пошаговые протокол дополнена Методические заметки для выполнения метода. В частности влияние клеточный цикл на γH2AX очагов модели проявляется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF. Кроме того значение очагов γH2AX качестве биомаркера изображен в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека. Наконец генетическая нестабильность в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемии расследуется иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.
Introduction
ДНК постоянно разрушен эндогенных (например, стресс репликации, реактивнооксигенных видов, внутренняя нестабильность ДНК) и внешних (например, химических радикалов, облучение) источников (рис. 1)1,2 ,3,4. Среди повреждения ДНК двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются особенно серьезных поражений и может вызвать смерть клетки или канцерогенеза. Около 50 ОУС могут возникнуть за5клеток и клеточного цикла. В клетках млекопитающих гомологичная рекомбинация (HR) и nonhomologous конце присоединение (NHEJ) разработан как основных путей для ремонта ДГЖД (рис. 2). HR происходит в конце S/G2 фазе и использует нетронутыми сестра хроматиды как шаблон для ремонта потенциально без ошибок. В сравнении NHEJ активным на протяжении клеточного цикла и потенциально мутагенных как пар могут быть добавлены или резецируется перед лигирование сломанной заканчивается. Кроме того альтернативные присоединения конца могут привлекаться в качестве механизма медленно мутагенных резервного восстановления в случае NHEJ дефицит6,7.
DSB побудить фосфорилирование гистон H2AX 139 Серина в регионе несколько пар megabase вокруг каждого DSB. Формируя ядерной очагов названы γH2AX очагов и поддаются обнаружению с помощью микроскопии иммунофлуоресценции8. ΓH2AX способствует набору далее DSB-отзывчивым белков и участвует в chromatin remodeling, репарации ДНК и трансдукции сигнала9. Как считается, что каждый γH2AX фокус представляют единый DSB, количественная оценка DSB, иммунофлуоресценции возможно, которая была продемонстрирована в рак клеточных линий и пациентов образцов10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другой ключевой белок в посредничестве DSB ремонт. Он участвует в наборе DSB-отзывчивым белков, контрольно-пропускной пункт сигнализации и Синапсис DSB заканчивается15. Кроме того 53BP1 играет решающую роль в выборе пути ремонт DSB. Это вызывает ремонт DSB к NHEJ время HR16. С учетом подлинных функций γH2AX и 53BP1 в ремонт DSB одновременный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть полезным методом для точного анализа формирования и ремонт DSB.
Эта рукопись содержит пошаговые протокол для выполнения иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 в клеточных ядер. В частности техника применяется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF, в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека и CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемией. Подробности метода указано в контексте представленных результатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 является полезным методом для анализа формирования и ремонт ДГЖД в широком спектре областей исследований. Критические параметры, которые влияют на результаты экспериментов являются фазы клеточного цикла, агенты, используемые для фиксации и permeabilization клет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект был поддержан фондом немецкого Хосе Каррерас лейкемии (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- . Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994)
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
