Summary

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Published: January 05, 2018
doi:

Summary

Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.

Abstract

I mitocondri sono organelli essenziali coinvolto in numerose vie metaboliche in piante, in particolare la produzione di adenosina trifosfato (ATP) dall’ossidazione di composti ridotti come nicotinamide adenindinucleotide (NADH) e la flavin adenina dinucleotide (FADH2). L’annotazione completa del genoma di Arabidopsis thaliana ha stabilito come il più diffuso sistema pianta modello, e così la necessità di purificare i mitocondri da una varietà di organi (foglia, radice o fiore) è necessaria per utilizzare pienamente gli strumenti che sono ora disponibili per Arabidopsis studiare biologia mitocondriale. I mitocondri sono isolati di omogeneizzazione del tessuto utilizzando una varietà di approcci, seguita da una serie di passaggi di centrifugazione differenziale producendo un pellet mitocondriale grezza che viene ulteriormente purificato mediante gradiente di densità colloidale continuo centrifugazione. Il materiale di densità colloidale viene successivamente rimosso da più passaggi di centrifugazione. A partire da 100 g di tessuto fogliare fresco, 2-3 mg di mitocondri possono essere ottenuti ordinariamente. Respiratori esperimenti su questi mitocondri visualizzare i tassi tipici di 100-250 nmol O2 min-1 mg proteina mitocondriale totale-1 (tasso di NADH-dipendente) con la possibilità di utilizzare vari substrati e inibitori per determinare quali substrati sono sono ossidati e la capacità delle alternative e citocromo ossidasi terminale. Questo protocollo descrive un metodo di isolamento dei mitocondri da foglie di Arabidopsis thaliana usare gradienti di densità colloidale continuo e un’efficiente misure respiratoria dei mitocondri pianta purificata.

Introduction

La storia della ricerca mitocondriale pianta ripercorre 100 anni1. I mitocondri intatti in primo luogo sono stati isolati all’inizio del 1950 mediante centrifugazione differenziale. L’avvento di un gradiente di densità colloidale nel 1980 ha permesso i mitocondri per essere purificata senza subire regolazione osmotica. Mentre gradienti mitocondri purificati sono adatti per la maggior parte degli scopi, a causa della sensibilità della spettrometria di massa, contaminanti anche relativamente minore possono essere rilevati e possono essere assegnati in modo inappropriato un mitocondriale posizione2. L’uso del libero flusso elettroforesi può rimuovere entrambi plastidic e peroxisome contaminazione3, ma il libero fluire l’elettroforesi è una tecnica altamente specializzata e non è richiesto per la stragrande maggioranza degli studi. Inoltre, si verifica quando determinazione della posizione di una proteina che deve essere ricordato che dual o targeting più delle proteine nelle cellule. Oltre 100 proteine mirate dual sono descritti per cloroplasti/plastidi e mitocondri4e un numero di proteine mirati ai mitocondri e peroxisomes sono noti anche5. Inoltre, la ri-localizzazione delle proteine sotto stimoli specifici, ad es. stress ossidativo, è un tema emergente nella cellula biologia6. Così, la posizione di proteine deve essere considerato nel contesto della biologia ha studiato, e una varietà di approcci sono utilizzati per determinare e verificare la posizione2.

I mitocondri sono in genere isolati dai tessuti vegetali di omogeneizzazione, è necessario un equilibrio tra rottura aprire la parete cellulare per rilasciare i mitocondri e non danneggiare i mitocondri. Tradizionalmente, con patate e cavolfiori, omogeneizzazione comporta l’uso di apparecchi domestici frullatore/spremiagrumi per rendere un estratto liquido in un buffer con vari componenti per mantenere attività. Isolamento dei mitocondri dalle foglie di pisello, (un materiale popolare per isolamento mitocondriale utilizzando giovani semenzali (~ 10 giorni), utilizza un frullatore per lisare le cellule come il materiale di foglia è morbido. Con la disponibilità di linee di knock-out inserzionali Arabidopsis thaliana T-DNA, la necessità di essere in grado di purificare i mitocondri per svolgere studi funzionali ha reso necessario lo sviluppo di metodi per isolare i mitocondri da foglia, radice o fiore tessuto. Nel complesso i metodi sviluppati per altre piante funzionato ben7, con il perquisite macinazione del materiale necessario per essere ottimizzato. Per Arabidopsis questo può essere realizzato in una varietà di modi (Vedi sotto) e differisce tra tipi di tessuto (radice contro sparare). L’uso del gradiente continuo può essere ottimizzata anche che la densità dei mitocondri da diversi organi o stadi di sviluppo significa che essi possono migrare in modo diverso. Così, per la massima separazione la densità della sfumatura può essere raffinata per garantire per ottenere una migliore separazione.

Una volta purificato i mitocondri possono essere utilizzati per una varietà di studi, compresi gli esperimenti di assorbimento proteico e tRNA, analisi di attività dell’enzima, catena respiratoria misurazioni e analisi western blot. Mitocondri isolati possono anche essere utilizzati per analisi di spettrometria di massa dell’abbondanza di proteine. Reazione più monitoraggio analisi (MRM) consente per la quantificazione della definite proteine, ma richiedono sviluppo di significative analisi mirate. Al contrario, quantificazione di dimetil o altro isotopo etichette8, fornisce un approccio di scoperta nell’identificare le differenze attraverso l’intero proteoma che può essere utilizzato per scoprire nuove conoscenze biologiche.

Protocol

Questo protocollo viene utilizzato per l’isolamento dei mitocondri intatti da organi di Arabidopsis thaliana coltivati su terreno con pendenze di densità colloidale continuo. La raccolta del materiale di seguito tutte le procedure sono effettuate a 4 ° C. 1. preparazione di macinatura media, lavare, soluzioni tampone e gradienti Preparare 300 mL di macinazione medio (meno ascorbato e cisteina) e 200 mL di tampone di lavaggio x 2 per ogni tabella 1 un giorn…

Representative Results

Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare diverse proteine mitocondriali di SDS-PAGE e immunoblotting. Come mostrato in Figura 3A, la proteina isolata dal tessuto di coltura di acqua è sufficiente per rilevare una debole banda (2 µ g). L’intensità del segnale aumenta in proporzione agli importi caricati. Per i mitocondri isolati dai tessuti coltivati sulle piastre (Figura 3B), la risposta allo stress di luce a…

Discussion

In genere, isolamento dei mitocondri da Arabidopsis lascia rendimenti a 3 mg di mitocondri da circa 80-100 3 – 4 – settimana-vecchi impianti, anche se rese superiori a 5 mg possono essere realizzate spesso con accurata macinazione. Il rendimento varia con le condizioni di crescita e diminuisce drammaticamente come foglie ratti senesce, anche se i mitocondri struttura sembra essere ben mantenuto durante la senescenza9. Una delle caratteristiche più importanti per ottenere una buona resa è il meto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da un australiano ricerca Consiglio centro di eccellenza in pianta energia biologia CE140100008, un australiano Consiglio futuro assegno di ricerca (FT130100112) di MWM e un assegno di ricerca di Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondazione, Germania) a JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

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Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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