इलेक्ट्रो-न्यूट्रल ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के आवेदन
Summary
इस पांडुलिपि के अनुप्रयोगों का वर्णन प्रोटॉन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड और पैच clamping तरीकों प्रोटॉन परिवहन प्रणालियों की गतिविधि को मापने के लिए । इन तरीकों सामांयतः प्रोटॉन परिवहन गतिविधि, जैसे उदारवादी संवेदनशीलता, समय संकल्प और अपर्याप्त intracellular वातावरण नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीक की कुछ सीमाओं को दूर ।
Abstract
कोशिका झिल्ली के माध्यम से आयनों के परिवहन सेल अस्तित्व के लिए अपरिहार्य है कि कोशिका के भीतर और बाहर आयन सामग्री के ठीक नियंत्रण सुनिश्चित करता है । ये परिवहन तंत्र विशेष ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की गतिविधियों से मध्यस्थता कर रहे हैं. विशेष रूप से, पीएच गतिशीलता पतले प्लाज्मा झिल्ली प्रोटॉन द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (एच+) बाहर निकालना सिस्टम, जैसे ना+/H+ एक्सचेंजर (NHE) प्रोटीन परिवार । NHE विनियमन अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए व्यापक प्रयासों के बावजूद, NHE परिवार की जैव शारीरिक और आणविक संपत्तियों की हमारी वर्तमान समझ को प्रभावी ढंग से NHE गतिविधि को मापने के लिए तरीकों की सीमित उपलब्धता की वजह से अपर्याप्त है . इस पांडुलिपि में, हम NHE-प्रेरित एच+ प्रवाह को मापने के लिए रिकॉर्डिंग clamping पूरे सेल पैच के दौरान एच+चुनिंदा इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल किया. हम इस दृष्टिकोण का प्रस्ताव आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों के कुछ सीमाओं पर काबू पाने के लिए NHE गतिविधि को मापने, ऐसे रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट झिल्ली permeants के रूप में । वर्णित विधि का उपयोग कर NHE गतिविधि के माप उच्च संवेदनशीलता और समय संकल्प और intracellular H+ सांद्रता के अधिक कुशल नियंत्रण सक्षम बनाता है । H+-चुनिंदा इलेक्ट्रोड तथ्य यह है कि ट्रांसपोर्टर गतिविधि कोशिका झिल्ली के करीब निकटता में एक आयन ढाल बनाता है पर आधारित हैं । एक h+-चयनित इलेक्ट्रोड एक दोहराव, थरथरानवाला फैशन रिकॉर्ड में सेल झिल्ली से ऊपर और दूर चलती है कि एच+ फ्लक्स पर निर्भर है एक वोल्टेज अंतर । h+-चयनित इलेक्ट्रोड कक्ष से बाहर ले जाने के लिए h+ प्रवाह का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि पूरे-कक्ष कॉन्फ़िगरेशन में पैच दबाना विधि intracellular आयन संरचना को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, विशाल पैच दबाना तकनीक के आवेदन न केवल आयनों की intracellular संरचना के संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी लिपिड. NHE isoform 3 (NHE3) के ट्रांसपोर्टर गतिविधि phosphoinositides द्वारा NHE3 विनियमन के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए इस तकनीकी दृष्टिकोण का उपयोग कर मापा गया था.
Introduction
प्लाज्मा झिल्ली के पार आयनों और solutes के परिवहन कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए आवश्यक है और, इसलिए, जीवों की1. आयनों और solutes के चयनात्मक परिवहन विशेष चैनल और ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की एक सरणी द्वारा हासिल की है । इन प्रोटीन में उत्परिवर्तनों अक्सर नैदानिक स्थितियों की एक किस्म में परिणाम, चैनल और ट्रांसपोर्टर प्रोटीन औषधीय उपचार के लिए संभावित लक्ष्य1। दुर्भाग्य से, चैनल और ट्रांसपोर्टर समारोह और विनियमन अंतर्निहित तंत्र को समझने अक्सर उनके गतिविधि2,3,4अध्ययन करने के लिए उपलब्ध दृष्टिकोण द्वारा सीमित है ।
विशेष रूप से, ट्रांसपोर्टरों मोटे तौर पर उप हो सकता है कि वे solutes के परिवहन के दौरान सेल transmembrane क्षमता में परिवर्तन के आधार पर दो बड़े समूहों में विभाजित: फेरबदल electrogenic आयन ट्रांसपोर्टरों [जैसे, सोडियम-फॉस्फेट सह-ट्रांसपोर्टर 2a (NaPi2a), सोडियम-कैल्शियम एक्सचेंजर (NCX), आदि.] या गैर फेरबदल electroneutral आयन ट्रांसपोर्टरों [जैसे, सोडियम-प्रोटॉन एक्सचेंजर (NHE), सोडियम-क्लोराइड सह ट्रांसपोर्टर, NaPi2c, आदि.] । ट्रांसपोर्टर्स के दोनों वर्गों की गतिविधियों को बड़े पैमाने पर रेडियोधर्मी आइसोटोप और फ्लोरोसेंट झिल्ली-permeant रंजक2का उपयोग कर का अध्ययन किया गया है । दोनों दृष्टिकोण विशिष्ट cytoplasmic आयनों के थोक एकाग्रता में परिवर्तन को मापने के द्वारा ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि का अनुमान है, और दोनों तरीकों की सीमाओं, जैसे उदारवादी संवेदनशीलता और समय संकल्प और intracellular के अपर्याप्त नियंत्रण के रूप में है वातावरण. दरअसल, कई ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि किया आयनों के cytoplasmic एकाग्रता पर निर्भर है (जैसे, NHE3, NCX), और इन आयन सांद्रता में परिवर्तन ट्रांसपोर्टर गतिविधि को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए उम्मीद कर रहे हैं2 , 3 , 5. इन विनियमित तंत्र के सटीक माप शास्त्रीय तरीकों का उपयोग कर सीमित है ।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, ट्रांसपोर्टर गतिविधि2,6का अध्ययन करने के लिए पैच क्लैंप तरीकों का उपयोग किया जाता है । विशेष रूप से, स्व-संदर्भित आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड (ISEs)7,पैच clamping प्रणाली के साथ संयुक्त8 हाल ही में electroneutral ट्रांसपोर्टर गतिविधि3,4 के माप की अनुमति दी है , 5. ISEs तथ्य यह है कि ट्रांसपोर्टर गतिविधि कोशिका झिल्ली के करीब निकटता में एक आयन ढाल बनाता है पर आधारित हैं । एक दोहराव, थरथरानवाला फैशन रिकॉर्ड एक वोल्टेज अंतर (µV) में सेल झिल्ली से और दूर करने के लिए एक िसे चलती है । वोल्टेज मतभेद आयन फ्लक्स में परिवर्तित किया जा सकता है एक अंशांकन विधि है कि प्रसार2,9के पहले कानून फिक लागू होता है का उपयोग कर । जबकि ISEs आयनों कोशिकाओं से बाहर ले जाने के प्रवाह का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, दोनों पूरे सेल या अंदर-बाहर विन्यास में पैच दबाना विधि झिल्ली क्षमता और intracellular आयन संरचना को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, विशाल पैच दबाना तकनीक के आवेदन न केवल आयनों की intracellular संरचना के संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी लिपिड और प्रोटीन3,5.
संक्षेप में, के साथ की तुलना में पैच दबाना विधि की बहुमुखी प्रतिभा के अन्य तरीकों का अध्ययन करने के लिए ट्रांसपोर्टर गतिविधि पैच इन अन्य तरीकों की आम सीमाओं को दूर करने के लिए उपयुक्त clamping बनाया है. आत्म संदर्भित ISEs और पैच दबाना तकनीक का संयोजन एक कसकर नियंत्रित प्रयोगात्मक वातावरण में electroneutral ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को मापने के लिए अद्वितीय संभावना प्रदान करता है और उपंयास भौतिक और आणविक खोज सेल झिल्ली परिवहन के गुण3,4,5। इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक NHE की गतिविधि का अध्ययन किया गया है । स्तनधारी NHE प्रोटीन परिवार extracellular प्रोटॉन (ज+)10,11 का उपयोग एक आवक ना+ ढाल के लिए catalyzes सोडियम (na+) के electroneutral नेट एक्सचेंज । स्तनधारी, NHE प्रोटीन परिवार में 11 संबंधित प्रोटीन (NHE1-9 और NHA1-2) और एक शुक्राणु विशिष्ट NHE10,12,13शामिल हैं ।
NHEs (SLC9a परिवार) सरल prokaryotes से उच्च eukaryotes में सबसे अधिक जीवित जीवों में बैरे पाया जाता है और में सेल लवणता रक्षा को नियंत्रित करने सहित महत्वपूर्ण सेल कार्यों की एक किस्म में शामिल हैं10,11, prokaryotes, अम्ल-आधार homeostasis और कोशिका की मात्रा को बनाए रखने, और विभिन्न विशिष्ट epithelia में नमक और पानी के अवशोषण को विनियमित करने के लिए10,12,14,15. NHEs की प्रमुख जैविक भूमिकाओं और उनके कार्यों के महत्व को कई अध्ययनों के माध्यम से निर्धारित किया गया है; हालांकि, कुछ अध्ययनों methodological सीमाओं के कारण स्तनधारी NHEs के भौतिक और आणविक गुणों की जांच की है4। हाल ही में, स्वयं के आवेदन-संदर्भित ISEs पूरे सेल पैच clamping के दौरान NHE आयनों, प्रोटीन और फॉस्फोलिपिड के intracellular सांद्रता में परिवर्तन द्वारा विनियमित isoforms के उपंयास आणविक तंत्र से पता चला है, 4.
विशेष रूप से, इस पांडुलिपि में प्रदान की प्रोटोकॉल और गतिविधि और NHE isoform 3 (NHE3), एनए के अवशोषण में एक प्रमुख खिलाड़ी के विनियमन के अध्ययन के लिए तरीकों और दृष्टिकोण की रूपरेखा, सीएल–, HCO3– और में तरल पदार्थ गुर्दे और आंत्र epithelia के ब्रश सीमा झिल्ली14,16। intracellular phosphoinositides को NHE3 गतिविधि की संवेदनशीलता में मतभेदों में नई अंतर्दृष्टि (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [pi (4, 5) P2] और phosphatidylinositide 3, 4, 5-ट्राइफॉस्फेट [pi (3, 4, 5] p]) की सूचना दी है । चैनल और ट्रांसपोर्टरों के रूप में सेल परिवहन प्रोटीन, phosphoinositides द्वारा विनियमित रहे हैं17, और NHE3 सीधे दोनों pi (4, 5) P2 और pi (3, 4, 5) p18से बाइंड कर देता है । वर्तमान साहित्य के आधार पर, या तो phosphoinositide के शारीरिक या pathophysiological विनियमन के लिए प्रासंगिक हो सकता है NHE35,18,19। हमारे निष्कर्षों NHE3 गतिविधि के विनियमन में pi (4, 5) P2 और pi (3, 4, 5) p के लिए अलग भूमिकाओं का समर्थन. यह अंतर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में िसे तकनीक के आवेदन के कारण संभव हो गया था । यह तकनीक भी NHE3 गतिविधि की माप के दौरान अलग phosphoinositides के intracellular छिड़काव के माध्यम से phosphoinositide सेलुलर सामग्री के नियंत्रण की अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्रांसपोर्टरों के महत्वपूर्ण कार्यों के बावजूद, उनकी गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों अप्रभावी और अपर्याप्त हैं । एक सीमा है कि उपलब्ध तरीकों को मापने आयन प्रयोग के दौरान intracellular आयन संरचना म…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एरिक Fishback (des Moines विश्वविद्यालय, डेस Moines, आयोवा, संयुक्त राज्य अमेरिका) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा शूटिंग और वीडियो संपादन के साथ उनकी सहायता के लिए । PS120 fibroblast की तरह NHE3-wt या NHE3-YRK पर छुरा व्यक्त कर रहे थे कृपया डॉ मार्क Donowitz (जॉंस हॉपकिंस मेडिसिन, बाल्टीमोर, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय स्कूल) द्वारा प्रदान की ।
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
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