Применение измерений электрофизиологии для изучения деятельности перевозчиков электро нейтральный
Summary
Эта рукопись описывает приложений Протон селективного электрода и патч зажима методы для измерения активности Протон транспортных систем. Эти методы преодолеть некоторые ограничения методов, обычно используется для изучения Протон транспортной деятельности, например умеренной чувствительности, разрешение времени и недостаточно внутриклеточной среды управления.
Abstract
Транспорт ионов через клеточные мембраны обеспечивает точное управление содержанием ионов внутри и вне клетки, что является необходимым условием для выживания клетки. Эти механизмы транспорта опосредованной деятельностью специализированных транспортер белков. В частности, динамика рН тонко контролируется плазматической мембраны Протон (H+) экструзионных систем, например Na+/час+ теплообменником (NHE) белка семьи. Несмотря на активные усилия для изучения механизмов лежащие в основе регулирования NHE нашего нынешнего понимания биофизических и молекулярных свойств NHE семьи недостаточно из-за ограниченности методов эффективной оценки деятельности NHE . В этой рукописи, мы использовали H+-селективный электроды во время поклеточного патч зажимной запись для измерения потока H NHE-индуцированной+ . Мы предложили, что этот подход для преодоления некоторых ограничений обычно используются методы для измерения активности NHE, например поглощение радиоактивных и флуоресцентные мембраны permeants. Измерение активности NHE, с помощью метода описаны обеспечивает высокую чувствительность и разрешение по времени и более эффективного контроля над внутриклеточной концентрации H+ . H+-селективного электрода, основывается на том, что перевозчик деятельность создает ионный градиент в непосредственной близости к клеточной мембраны. H+-селективный электрод до перемещения и подальше от клеточной мембраны в повторяющихся, колебательные моды записывает разница напряжения, что зависит от потока H+ . Хотя H+-селективный электроды используются для обнаружения потока H+ , перемещение из клетки, метод зажима патч в целом ячейки конфигурации используется для управления состав внутриклеточных ионов. Кроме того применение техники зажим гигантских патч позволяет изменения внутриклеточной состава не только ионы, но и липиды. Транспортер активность NHE изоформы 3 (NHE3) был измерен используя этот технический подход для изучения молекулярных основе NHE3 регулирования фосфоинозитидов.
Introduction
Транспорт ионов и растворенных веществ через мембраны плазмы имеет важное значение для выживания клеток и, следовательно, организмов1. Селективный транспорт ионов и растворенных веществ достигается массив специализированных каналов и транспортер белков. Мутации в эти белки часто приводят в различных клинических условий, предоставление канала и транспортер белки потенциальных целей для медикаментозное лечение1. К сожалению понимания механизмов, лежащих в основе функции канала и транспортер и регулирование часто ограничивается подходы, доступные для изучения их деятельности по2,3,4.
В частности, транспортеры примерно югу делятся на две большие группы, в зависимости от того, ли они изменяют трансмембранный потенциал клеток во время транспортировки растворенных веществ: изменения electrogenic ионных транспортеров [например, -фосфат натрия Совместное транспортер 2a (NaPi2a), обменный натрий кальций (NCX), и т.д.] или не изменяя Электронейтральная ионных транспортеров [например, обменный натрий Протон (NHE), хлоридно Сопредседатель транспортер, NaPi2c, и др.]. Деятельность обоих классов перевозчиков были изучены широко используя поглощение радиоактивных изотопов и Краски люминесцентные, флуоресцентные мембраны permeant2. Оба подхода оценить деятельность перевозчиков путем измерения изменения в массовой концентрации ионов конкретных цитоплазмы, и оба метода имеют ограничения, например умеренной чувствительности и времени резолюции и недостаточный контроль над внутриклеточной окружение. Действительно деятельность многих перевозчиков зависит цитоплазматическая концентрация ионов осуществляется (например, NHE3, NCX), и ожидается, что изменения в концентрации этих ионов играть значительную роль в регулировании деятельности перевозчик2 , 3 , 5. точное измерение этих регулирующих механизмов ограничена с использованием классических методов.
Чтобы преодолеть эти ограничения, патч зажим методы используются для изучения транспортер активность2,6. В частности самовызываемого ионоселективные электроды (МОСЭ)7,8 в сочетании с патч, зажимные системы недавно позволила измерения Электронейтральная транспортер деятельности3,4 , 5. ISEs, основывается на том, что перевозчик деятельность создает ионный градиент в непосредственной близости к клеточной мембраны. Ино, двигаясь вверх и от клеточной мембраны в повторяющихся, колебательные моды записывает разница напряжения (МКВ). Напряжения различия могут быть преобразованы в ионный поток значения с помощью метода калибровки, который применяет первый закон Фика диффузии2,9. Хотя ISEs используются для обнаружения потока ионов, движущихся из клеток, метод зажима патч в обоих поклеточного или наизнанку конфигурации используется для контроля потенциальных и внутриклеточных ионного состава мембраны. Кроме того применение метода зажим гигантских патч позволяет изменения внутриклеточной состава не только ионы, но и липидов и белков в3,5.
Таким образом универсальность метода зажим патч по сравнению с что других методов для изучения деятельности транспортер сделал патч зажима подходит для преодоления общих ограничений этих других методов. Комбинация ссылающиеся сами на себя ISEs и методы зажим патч предлагает уникальную возможность для измерения активности Электронейтральная транспортеров в жестко контролируемой среде экспериментальной и обнаружить роман биофизических и молекулярной свойства клеточной мембраны транспорт3,4,5. Этот подход успешно использовался для изучения деятельности NHE. У млекопитающих NHE белка семьи катализирует Электронейтральная чистого обмена внеклеточного натрия (Na+) для внутриклеточного Протон (H+)10,11 используя уклоном внутрь Na+ . В млекопитающих NHE белка семьи включает в себя 11 родственных белков (NHE1-9 и NHA1-2) и спермы конкретных NHE10,12,13.
NHEs (семейство SLC9a) встречаются повсеместно в большинстве живых организмов от простых прокариот для высших эукариот и участвуют в различных жизненно важных клеток функции10,11, включая управление защиты клетки солености в прокариот, поддержания кислотно щелочного гомеостаза и клетки объем и регулирование поглощения воды и соли в различных специализированных эпителия10,12,14,15. Биологическая роль NHEs и значение их функции были определены через несколько исследований; Однако несколько исследований изучили биофизических и молекулярные свойства млекопитающих NHEs из-за методологических недостатков4. Недавно применение ссылающиеся сами на ISEs во время пережатия поклеточного патч выявил новые молекулярные механизмы NHE изоформ регулируется изменения внутриклеточной концентрации ионов, белков и фосфолипидов в3, 4.
В частности, протокол в этой рукописи излагаются методы и подходы для изучения деятельности и регулирования NHE изоформы 3 (NHE3), одним из основных игроков в поглощении Na+, Cl–, HCO3– и жидкости в кисть границы мембрана почек и кишечного эпителия14,16. Новое понимание различия в чувствительности NHE3 активность внутриклеточных фосфоинозитидов (phosphatidylinositide 4,5-Бисфосфат [PI (4,5) P2] и phosphatidylinositide 3,4,5-трифосфата [PI(3,4,5]P3]) сообщается. Клетки транспортных белков, таких как каналы и перевозчиков, регулируются фосфоинозитидов17, и NHE3 прямо связывает PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5)18. Основываясь на существующей литературы, либо phosphoinositide может быть соответствующие физиологические или патофизиологические регулирования NHE35,18,19. Наши выводы поддерживают отдельные роли для PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5) в регулирование деятельности NHE3. Это различие стало возможным благодаря применение методов ISE в сочетании с поклеточного патч зажим записи. Этот метод также позволяет контроль клеточного содержания phosphoinositide через внутриклеточные перфузии различных фосфоинозитидов во время измерения NHE3 деятельности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на важнейших функций транспортеров методы, доступные для изучения их деятельности являются неэффективными и неадекватными. Единственным ограничением является, что доступные методы измерения ионного движения опосредовано транспортер деятельности без учета колебания внутр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Fishback (Университет Де-Мойн, Де-Мойн, Айова, США) за его помощь в съемки и редактирования видео. PS120 фибробластоподобных клеток, стабильно выражения NHE3-wt или NHE3-YRK были любезно предоставлены д-р Марк Донович (университете Джонса Хопкинса Школа медицины, Балтимор, MD, США).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
