Isolering og dyrkning af neurale stamceller efterfulgt af kromatin-Immunoprecipitation af Histon 3 lysin 79 Dimethylation Mark
Summary
Vi præsenterer en effektiv og reproducerbar metode til at isolere og kultur neurale stamceller fra embryonale og postnatal hjernevæv for kromatin immunoprecipitation (ChIP) af Histon 3 lysin 79 dimethylation (H3K79me2) – en Histon mark ligger inden for den kugleformede domæne af Histon 3.
Abstract
Hjernens udvikling er en kompleks proces, der styres i et temporo-rumlige måde af forløb af morphogens og forskellige transcriptional programmer. Derudover har epigenetiske kromatin ændringer, ligesom Histon methylering, en vigtig rolle for etablering og vedligeholdelse af specifikke celle skæbner i denne proces. Langt størstedelen af Histon methylering opstår på fleksible Histon hale, som er tilgængelige for Histon modifikatorer, viskelædere og Histon læseren proteiner. Derimod H3K79 methylering er placeret i den kugleformede domæne af Histon 3 og er involveret i forskellige udviklingsmæssige funktioner. H3K79 methylering er evolutionært bevaret og kan findes i en bred vifte af arter fra Homo sapiens at Saccharomyces cerevisiae. Ændringen indtræder i forskellige cellepopulationer i organismer, herunder neurale stamceller. Placeringen af H3K79 methylering i domænet kugleformede af Histon 3 gør det vanskeligt at vurdere. Her præsenterer vi metoder til at isolere og kultur kortikale stamfader celler (CPCs) fra embryonale kortikale hjernevæv (E11.5-E14.5) eller cerebellare kornede neuron stamfaderen (CGNPs) fra postnatal væv (P5-P7), og effektivt immunoprecipitate H3K79me2 for kvantitativ PCR (qPCR) og genome-wide sekventering.
Introduction
De sensoriske, motoriske og kognitive funktioner i hjernen er meget komplekse og modtagelige for fysiske og miljømæssige ændringer. Hjernen består af tre almindelige dele den hind-, midt-, og forhjernen, som er dybt forbundet. Inden for forhjernen, kan telencephalon opdeles i en dorsal telencephalon (DT) og en ventral telencephalon (VT). DT af mus består af seks kortikale lag, som er dannet mellem E11.5 og E18.5 i en “inside-out” måde1. VT omfatter de ganglionære eminences i udvikling, som senere danner de basale ganglier2,3. Flere celletyper kan klassificeres i pattedyr centralnervesystemet som neuroner, astrocytter, og oligodendrocytes4, der udvikler sig i en temporo-rumlige måde5. Først, de neurale stamceller (NPC) give anledning til forskellige former for neuroner, interneurons i VT og projektion neuroner i DT, og senere videre til glial celler (f.eks., astrocytter6). Under kortikale udvikling, den mest overfladiske lag (lag jeg), som indeholder Cajal-Retzius celler, dannes først. Derefter, mellem E12.5 og E14.5, NPCs generere dybere neuronal lag (VI, V) mens mellem 14,5 og 16,5, stamfaderen giver anledning til øverste lag (IV-II) neuroner7,8. Neuronal identitet er angivet ved forskellige morphogen-induceret temporo-rumlige transcriptional programmer og desuden epigenetiske programmer2.
Lillehjernen, som er impliceret i motor koordinering, ligger i baghjernen og udvikler mellem E10 og groft P20 i mus9. Det indeholder den cerebellare cortex og de cerebellare kerner10. Voksen cerebellare cortex består af tre lag, den yderste molekylære lag, Purkinje cellelag og den inderste granulerende lag indeholdende granulerede neuroner10. De cerebellare granula celler er de mindste neuroner og udgør omkring 80% af alle neuroner i hvirveldyr hjernen11. De udvikle sig fra prækursorer placeret i den ydre germinal zone og vandrer gennem Purkinje cellelag til deres destination12. Ligesom i telencephalon, udvikling af lillehjernen er reguleret af flere vigtige morphogens, defineret som har specifikke tid – og rum-afhængige funktioner og indlede transcriptional programmer10.
Udviklingen af kortikale og cerebellare lag kontrolleres af transcriptional udtryk for specifikke morphogens og således af kromatin staten af DNA. I en forenklet visning, kan kromatin stater opdeles i euchromatin som transcriptionally aktive og heterochromatin som transcriptionally tavs regioner. Nucleosome som den grundlæggende enhed af kromatin indeholder to kopier af hver kerne Histon H2A, H2B, H3 og H4, omgivet af 147 basepar af DNA13. Histoner er stærkt post-translationally ændret ved methylering, acetylation, fosforylering, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination og prolin isomerisation14,15. Histon lysin methylering er anset for at være den mest stabile Histon ændring, der styrer transskription, replikering, rekombination16, DNA-skade svar17og genomisk prægning18. Lysines kan være mono-, di- eller tri-methylerede19 og vises ikke kun på de tilgængelige Histon haler, men også inden for domænet kugleformede histoner20. Specifikke methylations på H3K4 og H3K36 er især forbundet med euchromatin, specifikke methylations på H3K9, H3K27 eller H4K20 er hovedsageligt findes i heterochromatic regioner, selv om alle rester er placeret inden for Histon hale14, 19,21. H3K79 methylering er placeret inden for domænet Histon kugleformede og har været forbundet med transcriptional aktivitet, men også med transcriptionally inert genomisk regioner22. Ændringen er evolutionært bevaret, da det er blevet observeret i gær, kalv thymus, kylling og menneskelige23. H3K79 mono-, di- og trimethylation (H3K79me1, me2, me3) er katalyseret af Histon methyltransferases DOT1L24,25 og nukleare sæt domæne indeholdende Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L er impliceret i spredning, DNA reparation og cellulære reprograming27. Tab af Dot1l i mus fører til en prænatal død omkring udviklingsstadiet E10.528,29. Under udvikling af hjertet og myocardiocyte differentiering er DOT1L afgørende for gen expression forordning30. I det centrale nervesystem, DOT1L funktion kan være impliceret i neuralrøret udvikling31, det er involveret i undertrykke Tbr1-udtryk under forhjernen udvikling32, og kan fungere i reguleringen af ER-stress svar gener33. Kontekst-afhængige aktivering eller undertrykke handling af H3K79me, især med i vivo situationer som udvikling af det centrale nervesystem, er til dato kun delvist forstået32. Da H3K79 methylering er placeret i domænet kugleformede af Histon 3, er det sterically mindre tilgængelige i forhold til ændringer på fleksible Histon haler23. For at forstå funktionen af H3K79 methylering, er pålidelig og reproducerbar analysemetoder til at bestemme dens placering og genomisk miljø nødvendige. I denne metoder papir præsenterer vi isolation metoder til forskellige neurale stamceller (CPC’er for cortex) og CGNPs til lillehjernen, effektiv DOT1L-hæmmer behandling, og en ChIP metode til at analysere H3K79 methylering via qPCR eller sekvensering på andet tidspunkt punkter i løbet af kortikale og cerebellare udvikling. En oversigt over protokollen og dens muligheder, se figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er to vigtige måder at udføre kromatin immunoprecipitation til påvisning af genomisk belægning af Histon ændringer, transkriptionsfaktorer, Histon kode læsere, forfattere eller viskelædere. Ene er metoden indfødte ChIP bruger nukleasen fordøjet, native kromatin for immunoprecipitation, og den anden er metoden præsenteres ved hjælp af PFA-fast, afrevne kromatin, hvor nucleosomes og andre DNA-attached proteiner er kovalent bundet til DNA 39. indfødte ChIP med sin høje antistof opdag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Henriette Bertemes for at hjælpe med at etablere CGN dyrkning protokol inden for laboratoriet. Denne metode papiret blev støttet af DFG-finansierede CRC992 medicinsk Epigenetik af finansieringen til TV. Forfatterne anerkender støtten fra Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning og Prof. Rolf Backofen, bioinformatik, universitetet i Freiburg, Tyskland finansieret af Collaborative Research Center 992 medicinsk Epigenetik (DFG grant SFB 992/1 2012) og tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
References
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
- Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
- Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
- Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
- McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
- Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
- Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
- Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
- Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
- Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
- Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
- Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
- van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
- Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
- Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
- Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
- Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).
