Summary

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Published: January 26, 2018
doi:

Summary

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) – eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Abstract

Die Entwicklung des Gehirns ist ein komplexer Prozess, der in gewissem Sinne Temporo-räumliche von Steigungen von Morphogens und verschiedene transkriptionelle Programme gesteuert wird. Darüber hinaus haben die epigenetische Chromatin Modifikationen, wie Histon-Methylierung, für Aufbau und Pflege von bestimmten Zelle Schicksale in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Die überwiegende Mehrheit der Histon-Methylierung tritt auf die flexible Histon-Schweif, die Histon-Modifikatoren, Radiergummis und Histonproteine Leser zugänglich ist. Im Gegensatz dazu H3K79 Methylierung befindet sich in der globulären Domäne von Histon 3 und ist in verschiedenen Entwicklungsstörungen Funktionen beteiligt. H3K79-Methylierung ist evolutionär konserviert und finden in den unterschiedlichsten Arten von Homo Sapiens zu Saccharomyces Cerevisiae. Die Änderung tritt in unterschiedlichen Zellpopulationen innerhalb von Organismen, einschließlich des neuronalen Vorläuferzellen. Die Lage der H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 macht es schwierig zu beurteilen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, zu isolieren und Kultur kortikalen Progenitor Zellen (CPCs) aus embryonalen kortikalen Hirngewebe (E11.5-E14.5) oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter (CGNPs) vom postnatalen Gewebe (P5-P7) und effizient immunoprecipitate H3K79me2 für quantitative PCR (qPCR) und genomweite Sequenzierung.

Introduction

Die sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen des Gehirns sind hoch komplex und anfällig für körperliche und ökologischen Veränderungen. Das Gehirn besteht aus drei allgemeine Teile der Hind-, Mittel-, und Vorderhirn, die zutiefst verbunden sind. Im Vorderhirn kann das Telencephalon in einer dorsalen Telenzephalon (DT) und einer ventralen Telencephalon (VT) unterteilt werden. Die DT von Mäusen besteht aus sechs kortikalen Schichten, die zwischen E11.5 und E18.5 in einer Art und Weise der “Inside-Out”1gebildet werden. Der VT umfasst die ganglionic Eminenzen in Entwicklung, die später die Basalganglien2,3bilden. Verschiedene Zelltypen lassen sich einteilen in den Säugetier-Zentralnervensystem wie Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten4, die in einem Temporo-räumliche Weise5zu entwickeln. Zunächst entstehen die neurale Vorläuferzellen (NPCs) verschiedene Arten von Neuronen, Interneuronen in der VT und Projektion Neuronen in der DT und später nach Gliazellen (z.B. Astrozyten6). Während der kortikalen Entwicklung, die oberflächlichste Schicht (Schicht I), Cajal-Retzius-Zellen enthält zuerst gebildet ist. Anschließend generieren NPCs zwischen E12.5 und E14.5, neuronale Tiefenschichten (VI, V) beim zwischen 14,5 und 16,5, Stammväter Anlass zu Oberschicht (IV-II) Neuronen7,8. Neuronale Identität wird von verschiedenen Morphogen-induzierte Temporo-räumliche transkriptionelle Programmen und zusätzlich durch epigenetische Programme2angegeben.

Das Kleinhirn, die motorische Koordination beteiligt ist, befindet sich in dem Hinterhirn und zwischen E10 und grob P20 in Mäusen9entwickelt. Es enthält die zerebelläre Kortex und zerebelläre Kerne10. Die Erwachsenen zerebelläre Kortex besteht aus drei Schichten, die äußerste molekulare Schicht, die Purkinje-Zellschicht und der innersten Körnerschicht enthält körnige Neuronen10. Die zerebelläre Granulat-Zellen sind die kleinsten Neuronen und repräsentieren rund 80 % aller Neuronen in der vertebrate Gehirn-11. Sie entwickeln aus Vorstufen in der externen germinal Zone gelegen und durchwandern der Purkinje Zelle Schicht auf ihre Ziel-12. Wie die Entwicklung des Kleinhirns im Telencephalon, durch mehrere wichtige Morphogens reguliert wird, definiert die bestimmte Zeit und Raum-abhängige Funktionen und initiieren transkriptionelle Programme10.

Die Entwicklung der kortikalen und zerebelläre Schichten wird durch transkriptionelle Ausdruck der spezifischen Morphogens und damit der Chromatin-Staat der DNA gesteuert. In einer vereinfachten Ansicht können Euchromatin als transcriptionally aktiv und Heterochromatin als transcriptionally leisen Regionen Chromatin Staaten aufgeteilt werden. Das Nukleosom als die grundlegende Maßeinheit des Chromatins enthält zwei Kopien von jedem Core-Histone H2A, H2B, H3 und H4, umgeben von 147 Basenpaare der DNA-13. Histone werden durch Methylierung, Acetylierung Phosphorylierung, Ubiquitination, Sumoylierung, ADP-Ribosylation, Deamination und Prolin Isomerisierung14,15hoch posttranslational modifiziert. Histon-Lysin-Methylierung gilt als die stabilste Histon-Modifikation, die Transkription, Replikation, Rekombination16, DNA-Schäden Antwort17und genomische Prägung18steuert. Lysines können Mono-, di- oder Tri-methylierte19 und erscheinen nicht nur auf den zugänglichen Histon-Schwänzen, sondern auch innerhalb der globulären Domäne der Histone20. Spezifische Methylations H3K4 und H3K36 vor allem mit Euchromatin verbunden sind, spezifische Methylations bei H3K9, H3K27 oder H4K20 sind vor allem in heterochromatischen Regionen gefunden, obwohl alle Rückstände der Histon Schweif14, liegen 19,21. H3K79-Methylierung befindet sich innerhalb der Histon globulären Domäne und transkriptionelle Aktivität, sondern auch mit transcriptionally inert genomische Regionen22zugeordnet wurde. Die Änderung ist evolutionär konserviert, da es in Hefe, Thymus Kalb, Huhn und menschlichen23beobachtet hat. H3K79 Mono, di und Trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sind durch die Histon-Methyltransferasen DOT1L24,25 und die nukleare SET Domain-haltige Protein 2 (Nsd2)26katalysiert. DOT1L ist in Proliferation, DNA-Reparatur und Mobilfunk umprogrammieren27verwickelt. Verlust von Dot1l bei Mäusen führt zu einer pränatalen Tod um die Entwicklungsphase E10.528,29. Während der Entwicklung von Herz und Myocardiocyte Differenzierung unbedingt DOT1L gen Ausdruck Verordnung30. In das zentrale Nervensystem, DOT1L Funktion im Neuralrohr Entwicklung31einbezogen werden könnte, sie engagiert sich bei der Unterdrückung der Tbr1-Ausdruck im Vorderhirn Entwicklung32, und funktionieren in der Verordnung von ER-Stress Antwort Gene33. Die Kontext-abhängige Aktivierung oder unterdrücken Einwirkung von H3K79me, vor allem mit in Vivo Situationen wie die Entwicklung des zentralen Nervensystems, ist bis heute nur teilweise verstanden32. Da H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 befindet, ist es im Vergleich zu Änderungen auf die flexible Histone Tails23sterisch weniger zugänglich. Um die Funktion der H3K79-Methylierung zu verstehen, brauchen wir zuverlässige und reproduzierbare Analyse-Methoden, seine Lage und genomische Umwelt bestimmen. In diesem Methoden-Papier präsentieren wir Ihnen Isolationsmethoden von verschiedenen neuronalen Vorläuferzellen (CPC-Gebote für den Kortex) und CGNPs für das Kleinhirn, wirksame DOT1L Inhibitor Behandlung und eine ChIP-Methode H3K79 Methylierung mittels qPCR oder Sequenzierung zu verschiedener Zeit analysieren Punkte während der kortikalen und zerebelläre Entwicklung. Für einen Überblick über das Protokoll und seine Möglichkeiten siehe Abbildung 1.

Protocol

Tierschutz Ausschüsse der Universität Freiburg und lokalen Behörden genehmigt alle Tierversuche (G12/13, G16/11) in das folgende Protokoll erwähnt. 1. Vorbereitungen Vorbereitungen für die CPCs Isolierung Richten Sie zeitgesteuerte Paarung um Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien Kortex (zwischen E11.5 und E14.5) zu erhalten. Verwenden Sie Mäuse des Stammes NMRI (Naval Medical Research Institute), die mindestens 8 Wochen alt sind. Betrachten…

Representative Results

Allgemeine Systematik der neuronalen Vorläuferzellen Isolation, Anbau, H3K79me2 ChIP und ChIP-Analyse-Methoden: Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm H3K79me2 ChIP der kortikalen Vorläuferzellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung des embryonalen Gehirns oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter in postnatale Phasen durchführen. Als ersten Schritt das Gehirn isoliert werden und das Telencephalon (zwischen E11.5 und E14…

Discussion

Es gibt zwei große Möglichkeiten, um führen Sie Chromatin Immunopräzipitation um die genomische Belegung der Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren, Histon-Code-Leser, Autoren oder Radiergummis zu erkennen. Eine ist die native ChIP-Methode mit Nuklease verdaut, native Chromatin für Immunopräzipitation, und die andere ist die vorgestellte Methode mit PFA-repariert, abscherend Chromatin, in dem die Nukleosomen und andere DNA-attached Proteine kovalent an die DNA gebunden sind 39. native…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für die Unterstützung der CGN-Anbau-Protokoll im Labor herstellen Henriette Bertemes. Dieser Methode Papier wurde von der DFG-geförderten CRC992 medizinische Epigenetik unterstützt, durch die Finanzierung zu TV. Die Autoren erkennen die Unterstützung von Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning und Prof. Rolf Backofen, Bioinformatik, Universität Freiburg, Deutschland finanziert Collaborative Research Center 992 medizinische Epigenetik (DFG Stipendium SFB 992/1 2012) Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF Grant 031 A538A RBC (de.) NBI)).

Materials

Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

References

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Cite This Article
Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

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