Isolering og dyrkning af voksen rotte Cardiomyocytes
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til isolering og dyrkning af voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC). Isolerede ARVC kan bruges til kort- og langsigtede dyrkning. Isolering og dyrkning af ARVC kan spille en central rolle i udviklingen af nye behandlingsregimer for hjerte sygdomme.
Abstract
I en intakt hjerte påvirke tilstødende celler voksne cardiomyocytes. Med metoden til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes er en nøjagtig undersøgelse af funktionaliteten af disse celler under specifikke behandlinger og miljøer muligt. Dette manuskript præsenterer en protokol for vellykket isolering og dyrkning af voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC).
Rotten er ofret af cervikal dislokation under dyb anæstesi. Derefter, hjertet er udvundet og aorta er afdækket. Efterfølgende, er perfusion på Langendorff perfusion system med calcium udtynding og collagenase behandling udført. Bagefter, ventrikulær væv bliver hakket, recirkuleret, og filtreret, efterfulgt af tre centrifugering trin med gradvis tilføjelse af CaCl2 indtil fysiologiske calcium koncentrationen er nået. ARVC er belagt på celle kultur retter. Efter forfriskende cellekulturmedium, kan ARVC være dyrket i op til seks dage uden at ændre næringssubstratet serum-holdige. Isolering af ARVC er en følsom proces, calcium. Små ændringer i den intracellulære calcium koncentration forårsage et fald i kvaliteten og levedygtigheden af de isolerede celler.
Frisk isoleret ARVC er stang formet. Inden for de første dage af dyrkningen mister de de stavformet morfologi og form pseudopodia-lignende strukturer (spredning). Under denne morfologiske dannelse ARVC oprindeligt forringe deres kontraktile elementer efterfulgt af en reformation gennem actin stress fibre og de novo sarcomerogenesis. Efter en uge med dyrkning, de fleste ARVC viser en udbredt udseende med en klart påviselig cross striation. Denne proces er følsomme over for intracellulære calcium koncentration, som behandling med ionomycin dæmper spredning. Vigtige markører i denne proces af de – og re – differentiation er β-myosin heavy chain (β-MHC), oncostatin Mikkelsen (OSM) og swiprosin-1 (EFHD2). Nylige undersøgelser har antydet, at hjertets re og deaktivere differentiation optræder under kultur efterligner funktioner set i vivo under hjerte remodellering. Derfor, isolering og dyrkning af ARVC spiller en central rolle i forståelsen af cardiomyocytes biologi.
Introduction
Voksen cardiomyocytes i vivo arbejde som en elektrisk syncytium baseret på celle-celle kontakter mellem myocytes. Derudover er de påvirket af tilstødende celler som hjerte fibroblaster, endothelial celler, neuroner og inflammatoriske celler1. For at studere cardiomyocytes evne til at tilpasse deres intracellulære organisation til ændret belastningsforhold, som set under Hjertehypertrofi, som er et indledende skridt fører til hjertesvigt, isolering og dyrkning af voksen ventrikulær rotte cardiomyocytes (ARVC) er nødvendigt2,3,4. Historisk, blev cardiomyocytes først isoleret fra embryonale chick hjerter5,6. Et par år senere, blev den første isolation af terminalt differentieret cardiomyocytes beskrevet ved hjælp af calcium udtynding7. Men disse voksen cardiomyocytes var ikke calcium tolerant og kunne derfor ikke bruges til funktionelle assays. Endelig, i 1976 en ny protokol aktiveret Powell og Twist at undersøge voksen ventrikulær cardiomyocytes under fysiologiske forhold8. Som et første skridt isoleres de voksne cardiomyocytes under lavt calcium koncentrationer og derefter øget calcium til fysiologiske koncentrationer i en trinvis procedure. I dag, de fleste protokoller til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes arbejde med denne protokol, calcium og bruge collagenase for enzymatisk fordøjelsen af tætte celle-celle kontakter1.
For en vellykket dyrkning er føtalt kalveserum (FCS) eller oncostatin M (OSM) påkrævet. ARVC udføre en de – og re – differentiation med omfattende strukturelle ændringer herunder sarkomeret demontering og reformationen9,10,11,12. Denne proces er ledsaget af en fornyet udtryk for føtal-type gener, som β-myosin heavy chain (β-MHC), som det kendes fra hypertrofi, og dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer, også kaldet sprede4,11, 13. Desuden swiprosin-1 (EFHD2), en nyligt identificerede proteiner, spiller en vigtig rolle ved at re differentiering af dyrkede ARVC11. Som et resultat, omdanne ARVC i kultur udbredt, polymorfe celler, som spontant Vis sammentrækninger efter to til tre uger i kultur2,4,14.
De seneste opdagelser har afsløret, at hjertets re og deaktivere differentiation som det sker kultur betingelser efterligner funktioner set i vivo under hjerte remodeling10,15. Hjerte remodellering er en central proces under hjerte sygdomme16. Som hjerte sygdomme er stadig den vigtigste dødsårsag i de industrialiserede samfund, en bedre forståelse af voksen cardiomyocytes biologi er vigtigt (der; 2015). Isolering og dyrkning af ARVC kan bidrage til at udvikle nye strategier og lægemidler til behandling af hjerte sygdomme. Med dette manuskript, er en protokol til isolering og dyrkning af ARVC leveret. Desuden, nogle vigtige dele af denne metode er fremhævet i afsnittet diskussion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionsmåden for voksen cardiomyocytes i vivo er påvirket af mange interaktioner med andre celler (f.eks., neuroner, endothelial celler, fibroblaster, inflammatoriske celler) og den elektriske syncytium, som de udgør1. Studerer stress tilpasning af voksen cardiomyocytes udelukkende kræver derfor, at isolering og dyrkning af ARVC. De vigtigste virkninger af afsondrethed og dyrke ARVC er: 1) afbryde dem fra ekstracellulære matrix og cell-celle kontakter; 2) afbryde dem fra k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Nadine Woitasky og Peter Volk for teknisk bistand. Derudover, takke forfatterne fru Claudia Lorenz (medicinsk forfatter, ACCEDIS) for hendes hjælp til at forberede håndskriftet. Dette manuskript blev støttet økonomisk af DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
