Isolasjon og dyrking av voksen rotte Cardiomyocytes
Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og dyrking av voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC). Isolerte ARVC kan brukes for kort og lang sikt dyrking. Isolasjon og dyrking av ARVC kan spille en nøkkelrolle i utviklingen av nye behandlingsregimer for hjerte sykdommer.
Abstract
I en intakt hjerte påvirke tilstøtende celler voksen cardiomyocytes. Med metoden for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes er en presis undersøkelse av virkemåten til disse cellene under spesifikke behandlinger og miljøer mulig. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for vellykket isolasjon og dyrking av voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC).
Rotta er ofret av cervical forvridning under dyp anestesi. Deretter trekkes ut hjertet og aorta er avdekket. Deretter utføres perfusjon på Langendorff perfusjon systemet med kalsium uttømming og collagenase behandling. Etterpå blir ventrikkel vev hakket, re-sirkulerer, og filtrert, etterfulgt av tre sentrifugering trinn gradvis tillegg CaCl2 til fysiologiske kalsium konsentrasjon er nådd. ARVC er belagt celle kultur retter. Etter forfriskende celle kultur medium, kan ARVC dyrkes i opp til seks dager uten å endre serum inneholder kultur medium. Isolasjonen av ARVC er en kalsium følsom prosess. Små endringer i intracellulær kalsium konsentrasjon forårsake en nedgang i kvalitet og levedyktigheten til isolerte cellene.
Fersk isolert ARVC er rod formet. I de første dagene av dyrking mister stav-formet morfologi og form pseudopodia-lignende strukturer (spredning). Under denne morfologiske formasjonen ARVC først redusere deres kontraktile elementer etterfulgt av en reformasjon gjennom begrepsordbok stress fibrene og de novo sarcomerogenesis. Etter en uke dyrking, de fleste ARVC viser en utbredt opptreden med en tydelig synlig tvers striation. Denne prosessen er følsomme for intracellulær kalsium konsentrasjon, som behandling med ionomycin demper sprer seg. Viktige indikatorer i denne prosessen av de – og re – differentiation er β-myosin tunge kjede (β-MHC), oncostatin M (OSM) og swiprosin-1 (EFHD2). Nyere studier har antydet at cardiac re – og de differentiation oppstår under oppdrettsforholdene etterligner funksjoner sett i vivo under cardiac remodeling. Derfor spiller isolasjon og dyrking av ARVC en viktig rolle i å forstå biologi av cardiomyocytes.
Introduction
Voksen cardiomyocytes i vivo arbeid som en elektrisk syncytium basert på celle-celle kontakter mellom myocytter. I tillegg påvirkes de av tilstøtende celler som cardiac fibroblaster, endotelceller, nerveceller og inflammatoriske celler1. For å studere evne til cardiomyocytes å tilpasse organisasjonen intracellulær til endret opplastingsforhold, sett i løpet av hjerte-hypertrofi, som et første trinn fører til hjertesvikt, isolasjon og dyrking av voksen ventrikkel rotte cardiomyocytes (ARVC) er nødvendig2,3,4. Historisk ble cardiomyocytes først isolert fra embryonale chick hjerter5,6. Noen år senere, ble første isolering av terminalt differensiert cardiomyocytes beskrevet ved hjelp av kalsium uttømming7. Men disse voksen cardiomyocytes var ikke kalsium tolerant og kan derfor ikke brukes for funksjonell analyser. Til slutt, i 1976 en ny protokoll aktivert Powell og vri undersøke voksen ventrikulær cardiomyocytes under fysiologiske forhold8. Som et første skritt isolerte de voksen cardiomyocytes under lav kalsium konsentrasjon og deretter økt kalsium til fysiologiske konsentrasjoner i en trinnvis prosedyre. I dag, de fleste protokoller for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes arbeide med denne kalsium-protokollen og bruke collagenase på enzymatisk fordøyelsen av tett celle-celle kontakter1.
En vellykket dyrking er fosterets kalv serum (FCS) eller oncostatin M (OSM) nødvendig. ARVC utfører en de – og re – differentiation med omfattende strukturendringer inkludert sarcomere demontering og reformasjonen9,10,11,12. Denne prosessen er ledsaget av et nytt uttrykk av fetal-type gener som β-myosin tunge kjede (β-MHC), som kjent fra hypertrofi og en formasjon av pseudopodia-lignende strukturer, også kalt spre4,11, 13. videre swiprosin-1 (EFHD2), en nylig identifisert protein, spiller en viktig rolle under re differensiering av dyrket ARVC11. Resultatet ARVC i kultur forvandle omfattende, sammensatte celler, som spontant Vis sammentrekninger etter to til tre uker i kultur2,4,14.
Nyere funn har avdekket at cardiac re – og de differentiation som den forekommer under oppdrettsforholdene imiterer har sett i vivo under cardiac remodeling10,15. CARDIAC remodeling er en viktig prosess under hjerte sykdommer16. Som hjerte sykdommer er fortsatt den viktigste dødsårsaken i industrialiserte samfunn, en bedre forståelse av biologi voksen cardiomyocytes er viktig (som, 2015). Isolasjon og dyrking av ARVC kan bidra til å utvikle nye strategier og legemidler for behandling av hjerte sykdommer. Med dette manuskriptet tilbys en protokoll for isolasjon og dyrking av ARVC. Videre merkes kritiske deler av denne metoden under diskusjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virkemåten til voksen cardiomyocytes i vivo er påvirket av mange interaksjon med andre celler (f.eksneurons endotelceller, fibroblaster, inflammatoriske celler) og den elektriske syncytium som utgjør1. Derfor krever studerer stress tilpasning av voksen cardiomyocytes utelukkende isolasjon og dyrking av ARVC. De viktigste effektene av isolering og dyrke ARVC er: 1) koble dem fra ekstracellulær matrix og celle-celle kontakter; 2) koble dem fra kontraktile stimuli; 3) tvinge dem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Nadine Woitasky og Peter Volk for teknisk assistanse. I tillegg takker forfatterne fru Claudia Lorenz (medisinsk skribent, ACCEDIS) for henne hjelp i å forberede manuskriptet. Dette manuskriptet ble økonomisk støttet av DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
