Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids
Summary
Un protocollo è descritto per la sintesi manuale di oligo-peptoids seguita da analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.
Abstract
Peptoids sono sequenza controllata oligomeri che imita il peptide che consiste in unità di glicina N-alchilati. Tra le molte applicazioni potenziali, peptoids sono stato pensato come un tipo di archiviazione di informazioni molecolari. Analisi di spettrometria di massa sono stato considerato il metodo di scelta per peptoids di sequenziamento. Peptoids possono essere sintetizzati tramite chimica in fase solida utilizzando un ciclo di reazione ripetuta in due fasi. Qui presentiamo un metodo per sintetizzare manualmente oligo-peptoids e per analizzare la sequenza della peptoids utilizzando tecniche di spettrometria di massa (MS/MS) tandem. L’esempio peptoid è un nonamer composto alternando glicina di N (2-methyloxyethyl) (Nme) e glicina di N (2-phenylethyl) (Npe), come pure una N-(2-amminoetil) glicina (Nae) al N-terminale. La formula di sequenza del peptoid è Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, dove Ac è il gruppo acetile. La sintesi avviene in un recipiente di reazione di fase solida disponibile in commercio. La resina di ammide pista è utilizzato come supporto solido per produrre il peptoid con un gruppo di ammide al C-terminale. Il prodotto peptoid risultante è sottoposto ad analisi di sequenza utilizzando uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione electrospray. La misurazione di MS/MS produce uno spettro di ioni frammento derivanti dalla dissociazione della carica peptoid. Gli ioni frammento vengono ordinati in base ai valori del loro rapporto massa / carica (m/z). I valori m/z degli ioni frammento vengono confrontati con le masse nominali degli ioni frammento teoricamente prevista, secondo lo schema di peptoid frammentazione. L’analisi genera un pattern di frammentazione della carica peptoid. Il modello di frammentazione è correlato alla sequenza di monomero della peptoid neutro. A questo proposito, analisi MS legge le informazioni di sequenza della peptoids.
Introduction
Peptoids sono una classe di polimeri sequenza controllata con strutture di spina dorsale che imita la struttura dei peptidi. Peptoids possono essere sintetizzati da diverse ammine, che permette di peptoids ad esporre proprietà altamente sintonizzabile1,2. Peptoids sono stati utilizzati come modelli molecolari per la ricerca biofisica, considerati come agenti terapeutici e progettato come leganti per proteine3,4,5,6. Peptoids sono stati sviluppati in una varietà di composti biologicamente attivi, quali materiali anti-incrostazione e anticorpo-mimetici, agenti antimicrobici e degli enzimi inibitori7,8,9. Con una natura altamente ordinata e sintonizzabile, peptoids hanno anche stato pensato come un tipo di informazioni molecolari deposito10. La scoperta di queste chiamate di diverse applicazioni per lo sviluppo di efficienti metodi analitici per caratterizzare la sequenza e la struttura di peptoids. Tecniche basate sulla spettrometria di massa tandem hanno indicato la promessa come il metodo di scelta per analizzare le proprietà di sequenza di sequenza controllata polimeri, tra cui peptoids11,12,13, 14,15. Tuttavia, gli studi sistematici correlando i pattern di frammentazione di ioni peptoid derivanti da studi di spettrometria di massa e le informazioni strutturali di peptoids sono molto limitati.
Peptoids possono essere facilmente sintetizzati utilizzando un metodo di fase solida. Il metodo ben sviluppato coinvolge un’iterazione di un ciclo di16,di due fasi monomero aggiunta17. In ogni ciclo di aggiunta, un’ammina associato a resina è acetilata da un acido di aloacetici (in genere acido bromoacetico, BMA), e questa è seguita da una reazione di spostamento con un’ammina primaria. Anche se i protocolli di sintesi automatizzata sono stati applicati ordinariamente per la sintesi di peptoid, peptoids possono essere sintetizzati manualmente con ottimi rendimenti in un standard chimica laboratorio16,18,19, 20.
Il nostro laboratorio ha adottato il metodo della sintesi di peptoid manuale e semplificato la strumentazione utilizzata per i metodi esistenti. In precedenza abbiamo studiato i modelli di frammentazione di una serie di peptoids utilizzando tecniche di MS/MS21,22,23. I nostri risultati indicano che peptoids producono caratteristici frammentazioni quando essi sono sottoposti alla dissociazione indotta da collisione (CID)21,23 o cattura elettronica esperimenti22 dissociazione (ECD). In questo articolo, dimostriamo come oligo-peptoids può essere sintetizzato in un laboratorio di chimica standard, come eseguire gli esperimenti di CID utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo e come analizzare i dati spettrali. Il peptoid essere sintetizzato e caratterizzato è un nonamer con acetilazione del N-terminale e C-terminale amidazione, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La struttura del peptoid è illustrata nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è stato sintetizzato utilizzando il protocollo presentato. L’apparecchio per la sintesi coinvolge un vaso di siringa-come reazione di fase solida in polipropilene e un agitatore meccanico. I vasi di reazione sono commercialmente disponibili e a basso costo. Agitatore meccanico è un apparato comune nei laboratori di chimica. Con l’uso di un recipiente di reazione simil-siringa, soluzioni possono essere trascinati e spinto fuori la nave spostando manualment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il signor Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) per l’assistenza tecnica in sintesi peptoid. Riconosciamo il sostegno della National Science Foundation (-1301505). Tutti gli esperimenti di spettrometria di massa sono stati condotti presso l’impianto di spettrometria di massa di chimica presso l’Università del Pacifico.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
