Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids
Summary
En protokoll som er beskrevet for manuell syntese av oligo-peptoids etterfulgt av sekvens analyse av massespektrometri.
Abstract
Peptoids er rekkefølgen-kontrollerte peptid-mimicking oligomers bestående av N-alkylated glysin enheter. Blant mange potensielle programmer, har peptoids vært tenkt på som en type av molekylære informasjonslagring. Massespektrometri analyse har vært vurdert metoden for valg for sekvensering peptoids. Peptoids kan syntetiseres via solid fase kjemi ved hjelp av en gjentatt totrinns reaksjon syklus. Her presenterer vi en metode å syntetisere manuelt oligo-peptoids og til å analysere en rekke peptoids med tandem massespektrometri (MS-/ MS) teknikker. Eksempel peptoid er en nonamer som består av vekslende N-(2-methyloxyethyl) glysin (Nme) og N-(2-phenylethyl) glysin (Npe), samt en N-(2-aminoethyl) glysin (Nae) på N-terminus. Rekkefølgen formelen for peptoid er Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, der Ac er gruppen acetyl. Syntese foregår i en kommersielt tilgjengelig solid-fase reaksjonen fartøyet. Skøytebane amid harpiks brukes som solid støtte til peptoid med en amid gruppe på C-terminus. Det resulterende peptoid produktet er utsatt for sekvensen analyse ved hjelp av en trippel-quadrupole masse spectrometer koplet til en electrospray ionization kilde. MS-/ MS målingen produserer et spekter av fragment ioner som følge av ladet peptoid. Fragment ioner sorteres basert på verdiene i sine masse-til-lade ratio (m/z). M/z-verdier fragment ioner sammenlignes mot nominell massene teoretisk spådd fragment ioner, i henhold til ordningen av peptoid fragmentering. Analysen genererer et fragmentering mønster av ladet peptoid. Fragmentering mønsteret er korrelert til monomer sekvensen av den nøytrale peptoid. I denne forbindelse, leser MS analyse ut sekvens av peptoids.
Introduction
Peptoids er en klasse av sekvens-kontrollerte polymerer med ryggraden strukturer mimicking strukturen av peptider. Peptoids kan bli syntetisert fra mangfoldig aminer, som gjør peptoids viser svært tunable egenskaper1,2. Peptoids har blitt brukt som molekylær modeller for Biofysiske forskning, ansett som terapeutiske agenter og utformet som ligander i proteiner3,4,5,6. Peptoids har blitt utviklet til en rekke biologisk aktive forbindelser, som anti-fouling og antistoff-mimetic, antimikrobielle midler og enzym-hemmere7,8,9. Med en svært organisert og tunable natur, har peptoids også blitt oppfattet som en type av molekylære informasjonen lagring10. Oppdagelsen av disse forskjellige programmer krever utviklingen av effektive analytiske metoder å karakterisere sekvensen og strukturen i peptoids. Tandem masse massespektrometri-baserte teknikker har vist lovende som metoden for valg for å analysere egenskapene sekvens av sekvens-kontrollerte polymerer, inkludert peptoids11,12,13, 14,15. Men systematiske studier samkjøre peptoid ion fragmentering mønstre som følge av masse massespektrometri studier og strukturinformasjon fra peptoids er svært begrenset.
Peptoids kan lett syntetiseres bruke en solid fase. Den godt utviklet metoden innebærer en gjentakelse av en to-trinns monomer tillegg syklus16,17. I hvert tillegg syklusen, en harpiks-bundet Amin er acetylated av en haloacetic syre (vanligvis bromoacetic acid, BMA), og dette etterfølges av en forskyvning reaksjon med en primær Amin. Selv om automatiserte syntese protokoller er rutinemessig brukt for peptoid syntese, kan peptoids syntetiseres manuelt med utmerket rentene i en standard kjemi laboratorium16,18,19, 20.
Våre lab har vedtatt metoden for manuell peptoid syntese og forenklet apparater i eksisterende metoder. Vi har tidligere studert fragmentering mønstre av en rekke peptoids med MS-/ MS teknikker21,22,23. Våre resultater viser at peptoids produsere karakteristiske fragmentations når de utsettes for kollisjon-indusert dissosiasjon (CID)21,23 eller electron-fangst dissosiasjon (ECD)22 eksperimenter. I denne artikkelen viser vi hvordan oligo-peptoids kan syntetiseres i et standard kjemi laboratorium, utføre CID eksperimenter med en trippel-quadrupole masse spectrometer og analysere spektraldata. Peptoid syntetisert og preget er en nonamer med N-terminal acetylation og C-terminalen amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Strukturen i peptoid er vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, har blitt syntetisert ved hjelp av protokollen presentert. Syntese apparatet innebærer en sprøyte-aktige polypropylen solid-fase reaksjon fartøyet og en mekanisk shaker. Reaksjon fartøyene er kommersielt tilgjengelig og rimelig. En mekanisk shaker er en vanlig apparater i kjemi laboratorier. Med bruk av en sprøyte-aktige reaksjon fartøyet, kan løsninger være trukket inn og skjøvet ut av fartøyet ved å manuelt flytte stempelet. Denne teknikken gj?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Mr. Michael Connolly og Dr. Ronald Zuckermann (The molekylær støperi, Lawrence Berkeley National Laboratory) for teknikk støtte i peptoid syntese. Vi anerkjenner støtte fra National Science Foundation (CHE-1301505). Alle massespektrometri eksperimentene ble utført på kjemi masse massespektrometri anlegget ved Universitetet i Stillehavet.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
