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Biology

एक Extracellular अंलीय पीएच संस्कृति प्रणाली की स्थापना

Published: November 19, 2017 doi: 10.3791/56660
Automatic Translation
1, 2
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

Summary

अंलीय ट्यूमर microenvironment ट्यूमर प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इन विट्रो में कैंसर की कोशिकाओं पर अंलीय extracellular पीएच के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हम सरल अंलीय संस्कृति प्रणालियों की स्थापना की ।

Abstract

इस तरह के हाइपोक्सिया या पोषक तत्व भुखमरी के रूप में ट्यूमर microenvironment, की शर्तों, कैंसर प्रगति और द्रोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । हालांकि, ट्यूमर बुद्धिमता और उसके अंतर्निहित तंत्र में अम्लीय extracellular पीएच की भूमिका hypoxic या पोषक तत्व भुखमरी की स्थिति की तुलना में बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है । इसके अलावा, अंलीय extracellular ट्यूमर microenvironment की नकल करने के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित संस्कृति विधि पूरी तरह से सूचित नहीं किया गया है ।

यहां हम एक सरल इन विट्रो संस्कृति विधि अम्लीय extracellular पीएच बनाए रखने के लिए कम बिकारबोनिट का उपयोग कर और वृद्धि हुई है और संस्कृति मध्यम में स्तनपान या एचसीएल सांद्रता वर्तमान । मध्यम पीएच के लिए निरंतर किया गया था कम से 24 और धीरे-PANC-1 और AsPC-1 अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं के ७२ ज निंनलिखित संस्कृति की कमी हुई । इस अध्ययन में तीन अलग अंलीय मीडिया की स्थिति MSMO1, INSIG1, और हाइपोक्सिया या पोषक तत्वों भुखमरी की तुलना में IDI1 के रूप में अत्यधिक विनियमित पीएच-उत्तरदायी जीन। इन जीनों के विनियमन अंलीय पीएच के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इन सरल तकनीकों के लिए अंलीय ट्यूमर microenvironment के तहत ट्यूमर द्रोह के अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट फायदेमंद होते हैं । इसलिए, हमारे extracellular अंलीय पीएच संस्कृति प्रणाली सेलुलर अंलीय पीएच प्रतिक्रियाओं की खोज में सक्षम बनाता है न केवल कैंसर की कोशिकाओं में, लेकिन यह भी प्राथमिक कोशिकाओं में, जैसे गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं सहित अंय अंलीय विकारों के संबंध में, मधुमेह ketoacidosis, लैक्टिक दाखवते, गुर्दे ट्यूबलर दाखवते, और श्वसन दाखवते.

Introduction

ट्यूमर microenvironment ट्यूमर प्रगति और कैंसर सेल चयापचय1,2,3में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कैंसर की कोशिकाओं को अक्सर ऐसी हाइपोक्सिया के रूप में शर्तों को उजागर कर रहे हैं, पोषक तत्व अभाव, और अंलीय extracellular पीएच (pHe) । हालांकि, ट्यूमर प्रगति में pHe की भूमिका के रूप में बड़े पैमाने पर के रूप में हाइपोक्सिया या पोषक तत्वों भुखमरी में स्पष्ट नहीं किया गया है । ट्यूमर ऊतक में pHe अंलीय बन सकता है, लगभग पीएच ६.८4,5तक पहुंच । अंलीय पीएच प्रोटॉन के एरोबिक और anaerobic glycolytic उत्सर्जन (एच+) से उत्पंन होता है और proliferating कैंसर की कोशिकाओं को5,6द्वारा स्तनपान कराना ।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि अंलीय pHe-प्रेरित citrullinated deacetylation, फैटी एसिड ऑक्सीकरण, और गंभीर अंलीय पर्यावरण के लिए अनुकूलन के लिए अंलीय lysosomes के exocytosis7,8,9,10। हालांकि, तंत्र के माध्यम से जो extracellular अंलीकरण कैंसर के व्यवहार को प्रभावित करता है और अंलीय पीएच ट्यूमर microenvironment में महत्वपूर्ण नियामकों की पहचान पूरी तरह से निर्धारित नहीं किया गया है । इसके अलावा, कई रिपोर्टों बिकारबोनिट, Tris, पाइप, और HEPES बफर या स्तनपान और एचसीएल के अस्पष्ट सांद्रता का उपयोग कर विभिंन अंलीय पीएच मीडिया का वर्णन किया है, लेकिन वहां कुछ रिपोर्टों को समायोजित माध्यम की स्थिरता और न ही व्यापक प्रदर्शन कर रहे है कई अलग अंलीय संस्कृति मीडिया7,8,9,10 की तुलना

extracellular अंलीकरण के सन्दर्भ में प्रमुख नियामकों और कैंसर कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तन स्पष्ट करने के लिए, हम एक अंलीय pHe को बनाए रखने के लिए एक सरल इन विट्रो संस्कृति मॉडल की स्थापना की और कैंसर कोशिकाओं में pHe की भूमिका की जांच की11. इस विधि का प्रयोग, हम ६.८ के एक pHe के साथ एक अंलीय संस्कृति माध्यम बनाए रखा ३७ डिग्री सेल्सियस के तहत 5% CO2, संस्कृति माध्यम में कम बिकारबोनिट सांद्रता का उपयोग कर । पीएच ७.४ सामान्य और नियंत्रण माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया गया था । मध्यम पीएच के लिए निरंतर किया गया कम से 24 और PANC-1 और AsPC-1 अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं की संस्कृति के दौरान धीरे से ७२ ज की कमी आई । क्योंकि बढ़ाया glycogen न केवल प्रोटॉन के उत्सर्जन में बढ़ौतरी, लेकिन यह भी स्तनपान कराने वाली7,8,9, हम भी एक संस्कृति की स्थापना के लिए स्तनपान को कम करने के बजाय से जोड़कर स्तनपान प्रेरित दाखवते नकल विधि बिकारबोनिट एकाग्रता. इसके अतिरिक्त, एचसीएल प्रेरित अम्लीय pHe माध्यम में हमें संभावना है कि अंलीय पीएच संस्कृति माध्यम के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं बिकारबोनिट की एक कम एकाग्रता के कारण नहीं कर रहे है बाहर करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, विभिंन बिकारबोनिट एकाग्रता के साथ ६.४ के लिए ७.४ के एक पीएच के साथ विभिन्न मीडिया का उपयोग कर, हम सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर pHe प्रभाव की हद का आकलन कर सकते हैं ।

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Protocol

1. अम्लीय संस्कृति माध्यम की तैयारी

  1. नियंत्रण की तैयारी (पीएच ७.४) और कम पीएच (पीएच ६.८) संस्कृति माध्यम
    1. L-glutamine बिना DMEM पाउडर के ४.७५ ग्राम को भंग कर ५०० मिलीलीटर पानी में ।
    2. एक दबाव तंग बोतल में ०.३३ मीटर NaHCO3 समाधान तैयार करें ।
      चेतावनी: यह महत्वपूर्ण है के बाद से एक दबाव तंग बोतल का उपयोग करें NaHCO3 सह उत्सर्जन2 गैस जब गरम और थर्मल रूप से विघटित ।
    3. माध्यम व समाधान आटोक्लेव. इन बफ़र्स 25 ° c करने के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें ।
    4. २०० मिमी एल-glutamine के 5 मिलीलीटर, पेनिसिलिन-streptomycin के 5 मिलीलीटर, और बिकारबोनिट के बिना DMEM के ५०० मिलीलीटर के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. नियंत्रण के लिए (pH ७.४) मध्यम, बिकारबोनिट के बिना DMEM की १०० मिलीलीटर प्रति ०.३३ M NaHCO3 समाधान के २.४ मिलीलीटर जोड़ें । कम पीएच के लिए (पीएच ६.८) मध्यम, बिकारबोनिट बिना DMEM के १०० मिलीलीटर प्रति ०.३३ मीटर NaHCO3 समाधान के ०.६ मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. ३७ ° c के तहत 5% सह में मशीन के 24 एच के बाद माध्यम पीएच की जांच करें2।
      नोट: NaHCO3 समाधान की राशि के माध्यम पीएच, जो मशीन और हवा के दबाव के सह2 सामग्री के आधार पर अलग कर सकते है पर निर्भर करता है समायोजित करने की जरूरत है । आदर्श रूप में, पहली बार के लिए, यह विभिंन बिकारबोनिट सांद्रता के साथ मध्यम पीएच उपाय करने के लिए NaHCO की उचित मात्रा में निर्धारित करने के लिए बेहतर है3 समाधान DMEM में जोड़ने के लिए ।
      1. संस्कृति माध्यम तुरंत सह2 मशीन से संस्कृति पकवान हटाने और पीएच एक पीएच मीटर का उपयोग कर मापने के बाद ले लीजिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मध्यम तापमान रखें यदि आवश्यक हो तो पानी के स्नान का प्रयोग । मध्यम पीएच तीन बार स्वतंत्र रूप से उपाय ।
        नोट: NaHCO3 समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और प्रत्येक मीडिया नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों जो इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
  2. स्तनपान प्रेरित या एचसीएल-प्रेरित अम्लीय संस्कृति माध्यम की तैयारी
    1. जोड़ें ७४ µ एल के स्तनपान समाधान या १२५ µ एल के 1 एम एचसीएल के १०० एमएल के लिए नियंत्रण मध्यम (चरण 1.1.5 में तैयार) ।
    2. ३७ ° c के तहत 5% सह में मशीन के 24 एच के बाद माध्यम पीएच की जांच करें2।
      नोट: स्तनपान या एचसीएल समाधान की राशि भी मध्यम पीएच, जो मशीन और हवा के दबाव में सह2 सामग्री के आधार पर अलग कर सकते है के अनुसार समायोजित करने की जरूरत है । आदर्श रूप में, यह मध्यम के वांछित पीएच को समायोजित करने के लिए उचित राशि का निर्धारण करने के लिए धारावाहिक स्तनपान कराने या एचसीएल सांद्रता के साथ मध्यम पीएच को मापने के लिए बेहतर है ।

2. कटाई और उपचार कोशिकाओं

  1. ३७ ° c के अंतर्गत 5% सह2 पर कोशिकाओं की खेती शुरू करने के लिए प्रयोग प्रदर्शन से पहले 1 सप्ताह से कम ।
    नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त कक्ष पंक्तियाँ सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
  2. यात्रा कोशिकाओं जब वे ७०-९०% तक पहुंचने के लिए प्रवाह । कोशिकाओं को धाराप्रवाह बनने की अनुमति न दें । दैनिक खेती के दौरान हर 2-3 दिन मध्यम बदलें ।
  3. 5 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़कर कोशिकाओं को धो लें । पंजाबियों को महाप्राण और ऐसे 1 एमएल Trypsin के रूप में अलग एंजाइम जोड़ें ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक कोशिकाओं गोल और अलग करने के लिए शुरू कर रहे हैं ।
  5. अलग कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एंजाइम निष्क्रिय । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन और ३०० x g पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक महाप्राण supernatant और फिर से संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को निलंबित स्थानांतरण ।
  6. एक hemocytometer और Trypan-नीला का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती ।
  7. बीज ५.० x 105 कोशिकाओं मध्यम के 10 मिलीलीटर में एक 10 सेमी पकवान/ ३७ ° c के तहत 5% CO2पर 24 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
  8. संस्कृति माध्यम महाप्राण, 5 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें, और खंड 1 में तैयार अम्लीय संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c के तहत 5% CO2पर 24 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन ।

3. आरएनए अलगाव

  1. 5 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ महाप्राण कल्चर मीडियम और वॉश सेल । आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट जोड़कर कोशिकाओं को बाधित ( सामग्री की तालिकाओंको देखें).
  2. पकवान संक्षेप में परिमार्जन, तो एक पिपेट के साथ आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट निकालें और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट/सेल lysate जमा । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
  3. जोड़ें २५० µ l क्लोरोफॉर्म और ट्यूब के बारे में 15 एस के लिए जोरदार हिला 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ और 5 मिनट के लिए ≥ ८,००० एक्स जी में केंद्रापसारक ।
  4. ध्यान से जलीय एक पिपेट का उपयोग कर चरण को दूर । जलीय चरण के कुछ पीछे छोड़ दें । एक और १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जगह है ।
  5. जलीय चरण में ५५० µ l isopropanol जोड़ें और धीरे से मिलाएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अधिकतम गति (≥ २०,००० x g) पर 5 min. केंद्रापसारक के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
  6. isopropanol बंद डालो और DEPC इलाज पानी में 1 मिलीलीटर ७५% इथेनॉल जोड़ें । मिश्रण धीरे । 5 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  7. इथेनॉल से पिपेट और छर्रों हवा सूख जाने ।
  8. DEPC की आरएनए गोली के लिए पानी का इलाज की (उपज पर निर्भर करता है) लगभग 15-25 µ एल जोड़ें । अच्छी तरह से मिलाएं ।
  9. एक spectrophotometer का उपयोग कर २६० एनएम पर आयुध डिपो को मापने के द्वारा पृथक आरएनए की एकाग्रता को मापने ।

4. सीडीएनए संश्लेषण

  1. एक पीसीआर में निंनलिखित घटकों का मिश्रण प्रतिक्रिया ट्यूब: अप करने के लिए 5 µ जी कुल आरएनए, 1 µ l Oligo dT (५० µ मीटर) या यादृच्छिक प्राइमरी मिश्रण (६० µ मीटर), 1 µ एल 10 मिमी dNTP, और nuclease-मुक्त पानी की कुल मात्रा को 14 µ l.
  2. मिश्रण और संक्षेप में एक छोटे benchtop केंद्रापसारक (~ 5 एस) का उपयोग कर घटकों को केंद्रापसारक । ६५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना आरएनए/ संक्षेप में स्पिन (~ 5 एस) एक छोटे से benchtop केंद्रापसारक का उपयोग कर और नमूना तुरंत बर्फ पर डाल के लिए ंयूनतम 1 मिनट ।
  3. निंनलिखित घटक जोड़ें: 4 µ एल 5x रिवर्स प्रतिलेखन बफर, 1 µ एल रिवर्स Transcriptase (२०० यू/µ एल), 1 µ एल RNase अवरोध करनेवाला (४० यू/µ एल) ।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उदाहरण सामग्री तालिका में दिखाए जाते है
  4. ट्यूब, मिश्रण कैप, और फिर संक्षेप में एक छोटे benchtop केंद्रापसारक का उपयोग कर सामग्री केंद्रापसारक (~ 5 एस) । 10 मिनट के लिए ५०-५५ डिग्री सेल्सियस पर संयुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण मशीन ।
  5. 10 मिनट के लिए ८० ° c पर मशीन द्वारा प्रतिक्रिया को निष्क्रिय ।

5. वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग एसिड उत्तरदायी जीन अभिव्यक्ति की माप

  1. ३८४-वेल रिएक्शन प्लेट में निम्न घटकों को संयोजित करें: 1 µ l टें पलेट सीडीएनए, ०.७५ µ l 10x N ', N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-मिथाइल-1, 3-benzothiazol-2-ylidene) मिथाइल] -1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1, 3-डायमाइन, ०.३ µ l ५० µ m फॉरवर्ड प्राइमरी, ०.३ µ l ५० µ m रिवर्स प्राइमरी, 1 µ l Taq पोलीमरेज़, २.५ µ l 10x Taq पोलीमरेज़ बफर, २.५ µ l 20 mM dNTP, १६.६५ µ l पानी.
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उदाहरण सामग्री की तालिकामें दिखाया गया है । प्राइमरों की एक सूची तालिका 1में दिखाई जाती है । एक ९६-well reaction थाली भी इस कदम में इस्तेमाल किया जा सकता है । अन्य जांच (उदा., Taqman जांच) का भी उपयोग किया जा सकता है ।
  2. एक वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम पर प्रयोग और निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम की स्थापना: 2 मिनट, 1 चक्र के लिए ५० ° c; 10 मिनट, 1 चक्र के लिए ९५ ° c; ९५ ° c 15 एस के लिए और ६० ° c 1 मिनट, ४० चक्र के लिए; 15 एस, 1 चक्र के लिए ९५ ° c; 15 एस, 1 चक्र के लिए ६० ° c; 15 एस, 1 चक्र के लिए ९५ ° c ।
  3. थाली को qPCR इंस्ट्रूमेंट में लगाएं । प्रोग्राम प्रारंभ करें ।
    नोट: पीएच उत्तरदाई जीन MSMO1, INSIG1, और IDI1 के विनियमन प्रोटीन के स्तर से मापा जा सकता है ।

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Representative Results

उपयुक्त बिकारबोनिट एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, हम 0-8 mMNaHCO 3 की सीमा पर DMEM तैयार (संस्कृति माध्यम में अंतिम एकाग्रता) और ६.४ से लेकर पीएच के साथ संस्कृति मीडिया तैयार करने में सफल-७.४(चित्रा 1). हम 8 मिमी NaHCO3 के साथ DMEM तैयार (पीएच ७.४) एक नियंत्रण माध्यम के रूप में, और 2 मिमी NaHCO3 (पीएच ६.८) एक पिछले रिपोर्ट के अनुसार अंलीय पीएच के साथ एक माध्यम के रूप में कहा कि extracellular पीएच ठोस ट्यूमर के लिए पीएच ६.८ तक पहुंचता है4,5। अम्लीय माध्यम का पीएच 24 एच के लिए निरंतर था, और धीरे-PANC-1 और AsPC-1 कोशिकाओं (चित्रा 2) की संस्कृति के दौरान ७२ ज के लिए लगभग पीएच ६.६ करने के लिए कमी आई । इसके बाद, स्तनपान या एचसीएल की राशि का निर्धारण करने के लिए नियंत्रण माध्यम (ph ७.४) को समायोजित करने के लिए पीएच ६.८ की आवश्यकता है, हम नियंत्रण माध्यम से स्तनपान या एचसीएल के विभिंन मात्रा में जोड़ा और मध्यम के पीएच मापा, और पाया कि एक अंतिम concentratio के साथ नियंत्रण माध्यम के पीएच n of २२.५ µ m स्तनपान कराने वाली और ६.२५ mM HCl ६.८ (चित्र 3) के मान पर पहुंच गई ।

कम पीएच के साथ एक माध्यम का उपयोग कर extracellular अंलीकरण के प्रभाव को आसानी से ऐसे MSMO1, IDI1, और INSIG1के रूप में अम्लीय पीएच-उत्तरदायी जीन के नियमन के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है । इन जीनों की अभिव्यक्ति हाइपोक्सिया या पोषक तत्व भुखमरी के तहत उनकी अभिव्यक्ति की तुलना में कम पीएच के तहत अत्यधिक बढ़ गया था (चित्रा 4) । इसके अतिरिक्त, इन जीनों का नियमन एक ऐसे माध्यम से विशिष्ट नहीं था जिसमें अम्लीय पीएच कम बिकारबोनिट स्तर की वजह से होता था, और वे भी एक माध्यम है जिसमें अम्लीय पीएच स्तनपान और/या एचसीएल के अलावा के कारण था द्वारा विनियमित थे (चित्रा 5) । मीडिया के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की तुलना जिसमें अंलीय पीएच कम बिकारबोनिट स्तर या स्तनपान या एचसीएल के अलावा से व्युत्पंन है हमें अगर सेलुलर प्रतिक्रियाओं अंलीकरण के कुछ प्रकार के लिए विशिष्ट है यह निर्धारित करने के लिए सक्षम बनाता है । इस तरह के IDI1, MSMO1के रूप में अंलीय पीएच जिंमेदार जीन के विनियमन, और extracellular कम पीएच के तहत INSIG1 भी सामांय कोशिकाओं (चित्रा 6) में होता है, तो हमारे विधि न केवल ट्यूमर कोशिकाओं पर भी सामांय कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है । उच्च पीएच शर्त के तहत, पीएच जिंमेदार जीन की अभिव्यक्ति स्तर PANC-1 और AsPC-1 कोशिकाओं (चित्रा 7) में विनियमित नहीं था, जो नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. NaHCO के बीच सहसंबंध3 एकाग्रता और मध्यम पीएच । क्षैतिज अक्ष NaHCO3 की एकाग्रता दिखाता है और अनुलंब अक्ष 5% CO 2 के अंतर्गत ३७ ° c पर मध्यम pH दिखाता है। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. ७२ एच संस्कृति के दौरान कम पीएच (पीएच ६.८) संस्कृति माध्यम के माध्यम पीएच के परिवर्तन । मध्यम पीएच 24 घंटे के लिए निरंतर था और धीरे-PANC-1 और AsPC-1 कोशिकाओं की संस्कृति के दौरान ७२ ज के लिए कमी आई । ५.० x 105 कोशिकाओं मध्यम के 10 मिलीलीटर, 24 घंटे के लिए मशीन में एक 10 सेमी डिश के लिए वरीयता प्राप्त थे, और कम पीएच संस्कृति के माध्यम से बदल दिया । डाटा कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. स्तनपान या एचसीएल सांद्रता और माध्यम के पीएच के बीच सहसंबंध । नियंत्रण मध्यम (पीएच ७.४) स्तनपान या एचसीएल के विभिंन सांद्रता के साथ बफर था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. कम पीएच के जवाब में अम्लीय पीएच-उत्तरदायी जीन के Transcriptional को विनियमित । MSMO1का व्यंजक स्तर, IDI1, और INSIG1 में उच्च था PANC-1 और AsPC-1 कोशिकाओं के संदर्भ में कम पीएच (पीएच) के तहत की तुलना में हाइपोक्सिया (एच) या पोषक तत्वों भुखमरी (एन एस) की शर्तों के बाद 24 ज. डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है कम तीन का मतलब ± SEM स्वतंत्र उपाययोजना आहेत. छात्राओं के टी-टेस्ट के संकेत की तुलना के लिए प्रदर्शन किया गया । p < 0.005 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. लैक्टिक दाखवते और एचसीएल की मध्यस्थता वाले दाखवते के जवाब में अम्लीय पीएच-उत्तरदायी जीनों का Transcriptional । की अभिव्यक्ति IDI1, MSMO1, और INSIG1 mRNAs PANC-1 कक्षों और AsPC-1 कक्षों में मात्रात्मक रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था नियंत्रण (कांग्रेस, पीएच ७.४), कम पीएच (पीएच; ph ६.८, NaHCO3 की राशि कम है ), लैक्टिक दाखवते (स्तनपान कराने वाली; पीएच ६.८, स्तनपान कराने की राशि में वृद्धि), और एचसीएल की मध्यस्थता वाले दाखवते (एचसीएल; पीएच ६.८, एचसीएल की राशि में वृद्धि) के लिए शर्तों 24 ज. आंकड़ों के अनुसार कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों का अर्थ ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । छात्राओं के टी-टेस्ट के संकेत की तुलना के लिए प्रदर्शन किया गया । p < 0.005 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. सामान्य कोशिकाओं में कम पीएच के जवाब में अम्लीय पीएच-उत्तरदायी जीन के Transcriptional को विनियमित. MSMO1, IDI1, और INSIG1 के एक्सप्रेशन स्तर को fibroblastic खरीफ-6, छूत, और MRC9 कोशिकाओं और endothelial HUVEC कोशिकाओं में विनियमित किया गया था 24 घंटे के बाद डेटा का मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । छात्राओं के टी-टेस्ट के संकेत की तुलना के लिए प्रदर्शन किया गया । p < 0.005 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7. उच्च पीएच के तहत अंलीय पीएच जिंमेदार जीन की अभिव्यक्ति स्तर (पीएच ७.६ ८.०) की तुलना में कम पीएच (पीएच ६.८) की स्थिति । पीएच के अभिव्यक्ति स्तर जैसे IDI1, MSMO1, और INSIG1 के रूप में जिंमेदार जीन उच्च पीएच (ph ७.६ to ८.०) शर्तों के तहत अपरिवर्तित रहता है PANC-1 और AsPC-1 कोशिकाओं में 24 घंटे के बाद डेटा का अर्थ ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है स्वतंत्र उपाययोजना आहेत. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी फॉरवर्ड प्राइमरी सीक्वेंस प्राइमरी रिवर्स pimer अनुक्रम
ACTB 5 '-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3 ' ACTB 5 '-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3 '
MSMO1 5 '-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3 ' MSMO1 5 '-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3 '
INSIG1 5 '-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3 ' INSIG1 5 '-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3 '
IDI1 5 '-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3 ' IDI1 5 '-CAACATCCGGCATAACTGTG-3 '

तालिका 1. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण में इस्तेमाल किया प्राइमरों की सूची ।

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Discussion

यहां, हम एक सरल अंलीय पीएच संस्कृति प्रणाली और उसके मूल्यांकन की प्रक्रिया का वर्णन । मध्यम अंलीकरण के तीन तरीकों के संयोजन, यानी, कम बिकारबोनिट एकाग्रता, स्तनपान के अलावा, और एचसीएल इसके अलावा, हमें पीएच प्रतिक्रिया तंत्र की जांच करने के लिए अच्छी तरह से सक्षम हैऔर अंय ट्यूमर के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की तुलना microenvironmental स्थितियां जैसे हाइपोक्सिया या पोषक तत्व भुखमरी ।

इस विधि की प्रमुख बिकारबोनिट, स्तनपान कराने वाली, और एचसीएल संस्कृति माध्यम में उचित सांद्रता का निर्धारण करने के लिए है । विभिंन बिकारबोनिट सांद्रता के साथ मध्यम पीएच मापने जब पहली बार के लिए इस पद्धति का प्रदर्शन माध्यम में NaHCO3 की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रक्रिया के दौरान, यह माध्यम पीएच मापने के लिए आवश्यक है ३७ डिग्री सेल्सियस में 5% सह के तहत 24 मशीन की2, मध्यम तापमान और सह के संतुलन स्थिति के रूप में2 बहुत मध्यम पीएच को प्रभावित । बिकारबोनिट के Autoclaving अक्सर सिफारिश की है, के रूप में बिकारबोनिट आसानी से फ्लैट हो जाता है । कोशिका घनत्व और कोशिका प्रवाह महत्वपूर्ण कारक हैं क्योंकि बढ़ती कैंसर कोशिकाओं की बड़ी संख्या को आसानी से संस्कृति माध्यम भी नियंत्रण के नमूनों में acidify. इसके अलावा, extracellular अम्लीय पीएच करने के लिए प्रतिक्रियाओं कोशिकाओं की स्थिति पर निर्भर करता है और कोशिकाओं को पारित कर रहे हैं के रूप में फीका हो सकता है, तो 10 से कम मार्ग के साथ कोशिकाओं प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया.

हमारे विधि काफी है 24 एच के लिए मध्यम पीएच की स्थिरता का प्रदर्शन किया और कई अंलीय पीएच मीडिया की तुलना में । इस प्रोटोकॉल में, ६.८ के माध्यम पीएच एक कम पीएच हालत के रूप में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन धारावाहिक पीएच ७.४ और ८.० के बीच बुनियादी पीएच मीडिया के अलावा ph ६.४ और ६.९, के बीच अम्लीय पीएच, extracellular अंलीकरण के खिलाफ सेलुलर प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

हम मुख्य रूप से कैंसर की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित है, लेकिन इस विधि stromal कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और संवहनी endothelial कोशिकाओं सहित ट्यूमर microenvironment के भीतर कोशिकाओं के अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम और अंय लोगों ने बताया कि कम से अधिक कैंसर की कोशिकाओं में कुछ पीएच संवेदनशील तंत्र सामांय कोशिकाओं7में आम हैं । यह भी अंय प्राथमिक कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए इस पद्धति को लागू करने के साथ ही भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल संभव है । इस संस्कृति प्रणाली की एक सीमा लंबी अवधि के प्रयोगों में अंलीय पीएच हालत बनाए रखने की कठिनाई हो सकती है ।

दाखवते विभिन्न प्रकार के रोगों से जुड़ा है । यह विधि न केवल कैंसर अनुसंधान में बल्कि मधुमेह ketoacidosis, गुर्दे ट्यूबलर दाखवते, और श्वसनी दाखवते जैसे अम्लीय विकारों का अध्ययन करने में भी लागू हो सकती है.

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Disclosures

लेखक Ayano कोंदो Kyowa Hakko किरिन कं, लिमिटेड के एक कर्मचारी है ।

Acknowledgments

हम सिस्टम जीवविज्ञान और चिकित्सा, RCAST, टोक्यो विश्वविद्यालय के लिए जीनोम विज्ञान और प्रयोगशाला के विभाजन के सदस्यों को धंयवाद । हम विशेष रूप से धंयवाद डॉ एच Aburatani, डॉ टी Kodama, (LSBM, RCAST, टोक्यो विश्वविद्यालय), डॉ के. के. Tomizuka, डॉ. टी योशिदा, और डॉ ए ।
Kunisato (Kyowa Hakko किरिन कं, लिमिटेड) उपयोगी चर्चा और समर्थन के लिए । यह काम आंशिक रूप से अनुदान द्वारा समर्थित था युवा वैज्ञानिक (एक) (२६७१०००५, T.O.) के लिए सहायता, अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अभिनव क्षेत्रों पर (२६११६७११ और 16H01567, T.O.), और अनुदान में सहायता के लिए चुनौतीपूर्ण
खोजपूर्ण रिसर्च (16K14605, T.O.) शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान और जापान के प्रौद्योगिकी, टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन (T.O.), कैंसर अनुसंधान के इस्सा फाउंडेशन (T.O.), और कैंसर अनुसंधान के लिए परियोजना से और चिकित्सीय विकास (पी-निर्माण) और जापान एजेंसी से चिकित्सा अनुसंधान और विकास, एमएड (T.O.) के लिए अभिनव कैंसर नियंत्रण के लिए व्यावहारिक अनुसंधान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 Nissui 05919
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10438
NaHCO3 Wako 191-01305
L-glutamine solution Thermo Fisher 25030-081
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) Nacalai 09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red Nacalai 32778-05
0.5%-Trypan Blue Stain Solution Nacalai 29853-34
Lactic acid solution Sigma-Aldrich 252476
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H9892
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN 74134
SuperScript IV First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18091
Power SYBR Green PCR Master Mix  Applied Biosystems 4368702 
Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
PANC-1 ATCC CRL-1469
AsPC-1 ATCC CRL-1682
KMS-6 JCRB Cell Bank JCRB0432
TIG JCRB Cell Bank
MRC9 ATCC CCL-212
HUVEC ATCC CRL-1730
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Fisher ND-ONE-W
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher CRL-1682

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १२९ Extracellular कम पीएच ट्यूमर microenvironment स्तनपान हाइपोक्सिया पोषक तत्वों भुखमरी संस्कृति विधि मध्यम
एक Extracellular अंलीय पीएच संस्कृति प्रणाली की स्थापना
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Kondo, A., Osawa, T. Establishment… More

Kondo, A., Osawa, T. Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System. J. Vis. Exp. (129), e56660, doi:10.3791/56660 (2017).

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