Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura
Summary
Il microambiente tumorale acide gioca ruoli critici nella progressione del tumore. Per valutare gli effetti del pH extracellulare acido sul cancro cellule in vitro, abbiamo istituito sistemi di semplice cultura acida.
Abstract
Condizioni del microambiente tumorale, quali ipossia o nutriente inedia, giocano un ruolo critico nella progressione del cancro e malignità. Tuttavia, il ruolo di pH acido extracellulare in aggressività del tumore e del suo meccanismo sottostante non è stato ampiamente studiato rispetto alle condizioni ipossiche o nutriente inedia. Inoltre, un metodo di cultura ben definita per imitare il microambiente tumorale extracellulare acido completamente non è stato segnalato.
Qui presentiamo un metodo di coltura semplice in vitro per mantenere acida pH extracellulare utilizzando ridotto bicarbonato e aumento del lattato o HCl concentrazioni nel terreno di coltura. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito da 72 h dopo coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Tre condizioni distinte media acide in questo studio altamente sovraregolati geni pH-sensible a reagire come MSMO1, INSIG1e IDI1 rispetto ad ipossia o nutriente inedia. Il upregulation di questi geni può essere utilizzato come un indicatore di pH acido. Queste semplici tecniche sono benefiche per delucidare i meccanismi di fondo di malignità del tumore sotto microambiente tumorale acide. Di conseguenza, il nostro sistema di cultura acida pH extracellulare consente l’individuazione di risposte cellulari pH acido non solo nelle cellule tumorali, ma anche nelle cellule primarie, come le cellule tubolari renali, nei confronti di altri acidi disordini compreso, chetoacidosi diabetica, acidosi lattica, acidosi tubulare renale e acidosi respiratoria.
Introduction
Il microambiente tumorale svolge un ruolo critico nella progressione del tumore e cancro cellula metabolismo1,2,3. Le cellule tumorali sono spesso esposti a condizioni quali ipossia, privazione nutriente e acida pH extracellulare (pHe). Tuttavia, il ruolo di pHe in progressione del tumore non è stato chiarito come ampiamente come ipossia o nutriente inedia. Il pHe nel tessuto del tumore può diventare acido, raggiungendo circa pH 6,84,5. Il pH acido nasce dall’aerobica ed anaerobica glicolitica escrezione di protoni (H+) e lattato di proliferazione del cancro cellule5,6.
Studi recenti hanno rivelato che acida indotta da pHe istone deacetilazione, ossidazione degli acidi grassi ed esocitosi dei lisosomi acidi per adattamento al severo ambiente acido7,8,9,10. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l’acidificazione extracellulare influenza cancro comportamento e l’identità della chiave regolatori nel microambiente tumorale pH acido completamente non sono stati determinati. Inoltre, parecchi rapporti descritti vari media di pH acido, utilizzando poco chiare concentrazioni di bicarbonato, Tris, tubi e HEPES buffer o lattato e HCl, ma ci sono pochi rapporti per dimostrare la stabilità del rettificata media né completa confronto di diversi distinti acide cultura media7,8,9,10
Per delucidare i regolatori chiave ed i cambiamenti metabolici in cellule tumorali nel contesto dell’acidificazione extracellulare, abbiamo stabilito un modello semplice in vitro della coltura per mantenere un pHe acide ed ha esaminato il ruolo di pHe in cancro cellule11. Utilizzando questo metodo, abbiamo mantenuto un terreno di coltura acida con un pHe di 6.8 a 37 ° C inferiore al 5% CO2, usando le concentrazioni ridotte di bicarbonato nel terreno di coltura. pH 7.4 è stato utilizzato come normale e medio di controllo. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito di 72 h durante la coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Perché avanzata glicolisi accelera l’escrezione di non solo protoni, ma anche del lattato7,8,9, abbiamo anche stabilito un metodo di coltura che imita acidosi indotta da lattato di aggiunta del lattato, invece di ridurre il concentrazione di bicarbonato. Inoltre, indotta da HCl acido pHe nel medio permette di escludere la possibilità che risposte cellulari a pH acido di coltura non sono dovuti a una ridotta concentrazione di bicarbonato. Inoltre, utilizzando vari mezzi di comunicazione con un pH di 6.4 a 7.4 con concentrazione di bicarbonato differenti, possiamo valutare l’entità degli effetti di pHe su risposte cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un sistema di coltura semplice pH acido e il suo processo di valutazione. La combinazione dei tre metodi di acidificazione medio, vale a dire, concentrazione ridotta di bicarbonato, aggiunta di lattato e aggiunta di HCl, ci ha permesso di indagare a fondo il meccanismo di pH-risposta e di confrontare la risposta cellulare ad altro tumore condizioni microambientali come ipossia o nutriente inedia.
La chiave di questo metodo consiste nel determinare le concentrazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri della divisione di scienza del genoma e laboratorio per sistemi di biologia e medicina, RCAST, The University of Tokyo. Ringraziamo in particolare Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, l’Università di Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida e Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) per utili discussioni e supporto. Quest’opera è stata in parte sostenuta da sovvenzione per scienziato (A) (26710005, T.O.), del giovane sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (26116711 e 16 H 01567, T.O.) e sovvenzione per sfidare
Ricerca esplorativa (16K 14605, T.O.) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone, la Fondazione di scienza di Takeda (T.O.), la Fondazione di Kobayashi della ricerca sul cancro (T.O.) e il progetto per la ricerca sul cancro e Evoluzione terapeutica (P-creare) e la ricerca pratica per la gestione innovativa cancro dal Giappone Agenzia per la ricerca medica e sviluppo, AMED (T.O.).
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis?. Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
