Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue
Summary
Ectopically manifestámos NR1 subunidade do receptor NMDA marcado com proteína verde fluorescente em células embrionárias humanas (HEK293) como antígeno para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes suspeitado com encefalite auto-imune. Este método simples pode ser adequado para fins em situações clínicas de triagem.
Abstract
A presença de auto-anticorpos de anti-NMDA receptor pode causar vários sintomas neuropsiquiátricos nos pacientes afetados, denominados encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor. Detecção dos auto-anticorpos específicos contra o receptor NMDA no sangue ou no líquido cerebrospinal (CSF) é essencial para o diagnóstico preciso desta condição. O receptor NMDA é um íon canaleta complexo proteico que contém quatro subunidades, incluindo dois subunidade obrigatória de receptores NMDA 1 (NR1) e um ou dois receptores NMDA 2A subunidade (NR2A), 2B de subunidade do receptor NMDA (NR2B), subunidade do receptor NMDA 2C (NR2C), ou o receptor NMDA subunidade 2D (NR2D). O epítopo de auto-anticorpos de receptor NMDA-anti foi relatado para estar presentes no domínio N-terminal extracelular de NR1 subunidade do receptor NMDA. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio de imunofluorescência baseada em célula simples que pode ser usado como um teste de triagem para detectar a presença de auto-anticorpos contra NR1 subunidade do receptor NMDA no sangue para facilitar a pesquisa clínica e básica de encefalite auto-imune do receptor NMDA-anti.
Introduction
Anti-NMDA receptor auto-imune encefalite é uma entidade de doença recentemente reconhecidas que pode ocorrer em pacientes de todas as idades e afeta predominantemente feminino pacientes1,2. É um da encefalite mais frequentemente diagnosticada entre os pacientes com etiologia desconhecida inicial de encefalite3. Pacientes afetados com encefalite do receptor NMDA anti geralmente têm sintomas prodrômicos de uma dor de cabeça ou febre, seguida pelo rápido desenvolvimento de mudança de nível de consciência e de uma variedade de sintomas neuropsiquiátricos agudas, incluindo agitação, irritabilidade , ansiedade, insônia, alucinações, delírios, agressividade, comportamentos bizarros, anormalidades do movimento, desregulação autonômica e apreensão ataca4,5. Reconhecimento precoce desta condição e tratamento atempado com imunoterapia são importantes para um resultado melhor e até completa recuperação em doentes afectados6. Portanto, sugere-se que a encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor deve ser considerada como um importante diagnóstico diferencial de pacientes que apresentam com características psicóticas agudas ou novo-início7,8.
Além de características clínicas, a detecção de auto-anticorpos contra os receptores NMDA no sangue ou CSF é essencial para o diagnóstico preciso de anti-NMDA receptor encefalite auto-imune9. A maioria dos testes imunológicos para detectar os auto-anticorpos de receptor NMDA anti estão disponíveis em algumas pesquisa laboratórios10,11, e há apenas um ensaio de imunofluorescência baseada em célula comercialmente disponível para rastreio do anti-NMDA receptor auto-anticorpos12. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio imunofluorescência de baseada em célula interna simples que pode ser convenientemente usado em laboratório para a tela a presença de auto-anticorpos de receptor NMDA anti para facilitar a pesquisa clínica do receptor NMDA anti encefalite auto-imune. O receptor NMDA é um heterotetramer íon canaleta complexo proteico especificamente expressado no cérebro. É feito de duas subunidades de NR1 obrigatórias e a combinação de uma ou duas subunidades de NR2A e NR2B, NR2C, NR2D13. Um estudo anterior relatou que o principal epítopo alvejado de anticorpos estava no domínio N-terminal extracelular do NR1 subunidade5. Daí, neste protocolo, podemos expressar a proteína NR1-subunidade recombinante humana do receptor NMDA com proteína verde fluorescente (GFP) na linha de células epiteliais de rim embrionário humano (HEK293) e desenvolver um ensaio imunofluorescência baseados em células para detectar a classe IgG de auto-anticorpos de receptor NMDA anti no sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários ensaios imunológicos cell-based para a tela a presença de auto-anticorpos contra o receptor NMDA relatados na literatura, incluindo imunofluorescência baseada em célula viva do ensaio11, fixada ensaio imunofluorescência baseada em célula9 , e baseados em citometria de fluxo do ensaio14. O ensaio de imunofluorescência baseada em célula ao vivo deve ser realizado logo após a preparação de células ectopically, expressando a p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação médica do Chang Gung (o número de concessão CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
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