Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Genta Ito; Taisuke Tomita

doi:10.3791/56688

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Biochemistry

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Published: December 14, 2017

doi:

10.3791/56688

Genta Ito, Taisuke Tomita²

¹Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences,The University of Tokyo, ²Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences,The University of Tokyo

Summary

Die vorliegende Studie beschreibt eine einfache Methode zur Erkennung von endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von Leucin-reiche wiederholen Kinase 2.

Abstract

Mutationen im Leucin-reiche wiederholen Kinase 2 (LRRK2) haben gezeigt, mit familiären Parkinson-Erkrankung (FPD) verknüpft werden. Da abnormale Aktivierung der Kinase-Aktivität von LRRK2 in der Pathogenese von Morbus Parkinson in Verbindung gebracht hat, ist es wichtig, eine Methode zur Evaluierung der physiologischen Ebenen die Kinase-Aktivität von LRRK2 zu etablieren. Neuere Studien gezeigt, dass LRRK2 Rab GTPase Familienmitglieder, einschließlich Rab10, unter physiologischen Bedingungen phosphorylates. Obwohl die Phosphorylierung des endogenen Rab10 von LRRK2 in kultivierten Zellen durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden konnte, ist es schwierig zu erkennen durch Immunoblotting aufgrund der schlechten Empfindlichkeit der derzeit verfügbaren Phosphorylierung-spezifische Antikörper für gewesen. Rab10. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zum Nachweis der endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 basierend auf Immunoblotting Verwendung von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kombiniert mit einem Phosphat-Bindung-Tag (P-Tag), die ist N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) –N,N’,N’– Tris (Pyridin-2-Yl-Methyl) – 1,3 – Diaminopropan-2-Ol. Dieses Protokoll nicht nur liefert ein Beispiel für die Methode, die Nutzung im P-Tags, sondern ermöglicht auch die Bewertung von Mutationen sowie Inhibitor Behandlung/Verwaltung oder andere Faktoren, wie alter der nachgeschalteten Signalisierung von LRRK2 in Zellen und Geweben .

Introduction

PD gehört zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, überwiegend dopaminergen Neuronen im Mittelhirn, beeinflussen, was zu Funktionsstörungen des motorischen Systems in Senioren¹. Während die meisten Patienten PD auf sporadische Weise entwickeln, gibt es Familien, die Krankheit zu erben. Mutationen in verschiedenen Genen wurden gefunden, mit FPD²verknüpft werden. Die verursachenden Gene für FPD gehört LRRK2, in denen acht Missense-Mutationen (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S und I2020T) verbunden mit einer dominant vererbten FPD genannt PARK8 bisher gemeldeten³^,⁴^,⁵gewesen sein. Mehreren genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) sporadische PD-Patienten haben auch genomische Variationen bei den LRRK2-Locus als Risikofaktor für PD, darauf hindeutet, dass die Anomalie in der Funktion von LRRK2 ist eine häufige Ursache für Neurodegeneration in beiden sporadisch identifiziert und PARK8 FPD⁶^,⁷^,⁸.

LRRK2 ist ein großes Protein (2.527 Aminosäuren) bestehend aus einer Leucin-reiche wiederholen Sie Domäne, ein GTP-Bindung Ras komplexe Proteine (ROC) Domäne, eine C-terminale ROC (ADR) Domäne, eine Serin/Threonin Protein Kinase-Domäne und einer WD40 wiederholen Domäne⁹. Die acht FPD-Mutationen finden in diesen funktionellen Domänen; N1437H und R1441C/G/H/S in der ROC-Domäne, Y1699C im Bereich ADR, G2019S und I2020T in der Kinase-Domäne. Da G2019S Mutation, die am häufigsten in PD Patienten¹⁰^,¹¹^,¹²Mutation gefunden wird, die Kinase-Aktivität von LRRK2 2-3 Fach in-vitro-¹³erhöht, wird es vermutet. dass die abnorme Zunahme der Phosphorylierung von LRRK2 Substrate giftig für Neuronen. Es war jedoch unmöglich zu prüfen, ob die Phosphorylierung von physiologisch relevanten LRRK2 Substraten in familiären/sporadische PD-Patienten aufgrund der fehlenden Methoden in abgeleiteten Patientenstichproben Bewertung geändert wird.

Protein-Phosphorylierung wird in der Regel durch Immunoblotting oder Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) mit Antikörpern, die spezifisch erkennen des phosphorylierten Zustands Proteine oder durch massenspektrometrische Analyse erkannt. Die ehemalige Strategie kann jedoch manchmal wegen der Schwierigkeiten bei der Schaffung von Phosphorylierung-spezifische Antikörper angewendet werden. Metabolische Kennzeichnung von Zellen mit radioaktivem Phosphat ist eine weitere Option, physiologische Ebenen der Phosphorylierung zu untersuchen, wenn Phosphorylierung-spezifischen Antikörper nicht leicht verfügbar sind. Aber es erfordert eine große Menge radioaktiver Stoffe und daher beinhaltet einige spezielle Ausrüstung für Strahlenschutz¹⁴. Massenspektrometrische Analyse ist empfindlicher gegenüber diesen immunchemische Methoden und populär bei der Analyse von Protein-Phosphorylierung. Jedoch die Probenvorbereitung ist zeitaufwändig und teuer Instrumente sind für die Analyse erforderlich.

Eine Teilmenge der Rab GTPase Familie einschließlich Rab10 und Rab8 wurde kürzlich berichtet, wie das Ergebnis eines umfangreichen Phosphoproteomic Analyse¹⁵direkte physiologische Substrate für LRRK2 zugrunde. Wir zeigten dann, dass Rab10 Phosphorylierung von FPD Mutationen im embryonalen Fibroblasten der Maus und in den Lungen von Profi Mäuse¹⁶erhöht wurde. In diesem Bericht, wir entschieden uns für eine Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) beschäftigen-basierte Methode, bei der ein P-Tag-Molekül Co polymerisierten in SDS-PAGE Gelen (P-Tag SDS-PAGE) zur Erfassung der endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung denn ein hochempfindlicher Antikörper spezifisch für phosphorylierten Rab10 noch fehlte. Wir haben versäumt, die Phosphorylierung des endogenen Rab8 aufgrund der schlechten Selektivität der derzeit verfügbaren Antikörper für insgesamt Rab8 erkennen. Daher entschieden wir uns konzentrieren auf die Rab10 Phosphorylierung. LRRK2 phosphorylates Rab10 bei Thr73 Ortung in der Mitte der Region hoch konservierte “Schalter II”. Hohe Erhaltung der Phosphorylierung Websites unter Rab-Proteine möglicherweise einer der Gründe, warum Phosphospecific Antikörper erkennen unterschiedliche Rab-Proteine schwer sind zu machen.

Die Phosphorylierung des Rab8A von LRRK2 hemmt die Bindung von Rabin8, ein Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) die Rab8A aktiviert, durch den Austausch der gebundenen BIP mit GTP¹⁵. Phosphorylierung von Rab10 und Rab8A von LRRK2 hemmt auch die Bindung von BIP-Dissoziation-Inhibitoren (GDIs), die wesentlich für die Aktivierung des Rab-Proteine durch die Gewinnung von BIP-gebundenen Rab-Proteine von Membranen¹⁵. Gemeinsam wird es vermutet, dass die Phosphorylierung des Rab-Proteine von LRRK2 sie Aktivierung daran hindert, obwohl die genauen molekularen Mechanismus und physiologischen Folgen der Phosphorylierung unklar bleiben.

P-Tag SDS-PAGE wurde erfunden von Kinoshita Et Al. 2006: bei dieser Methode wurde Acrylamid kovalent verbunden mit P-Tag, ein Molekül Erfassung Phosphate mit hoher Affinität, die in SDS-PAGE copolymerisiert Gele¹⁷. Da die P-Tag-Moleküle in einem SDS-PAGE Gel selektiv elektrophoretische Mobilität der phosphorylierten Proteine verzögern, kann P-Tag SDS-PAGE phosphorylierten Proteine von nicht phosphoryliert zu trennen (Abbildung 1). Wenn das Protein des Interesses auf mehrere Reste phosphoryliert wird, wird eine Leiter Bands differentiell phosphorylierten Formen entsprechend beobachtet werden. Im Falle von Rab10 beobachten wir nur eine verschobene Band darauf hinweist, dass Rab10 nur bei Thr73 phosphoryliert wird. Der große Vorteil der P-Tag SDS-PAGE über Immunoblotting mit Phosphorylierung-spezifischen Antikörpern ist, dass phosphorylierten Rab10 durch Immunoblotting mit Phosphorylierung-unspezifische Antikörper (d.h.erkennen total Rab10) nachgewiesen werden können nach auf Membranen übertragen wird, ist die in der Regel bestimmten, sensiblen und verfügbar aus kommerziellen/akademische Quellen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von P-Tag SDS-PAGE ist eine ungefähre Schätzung der Stöchiometrie der Phosphorylierung, erhalten kann, das ist unmöglich, durch Immunoblotting mit Phosphorylierung-spezifische Antikörper oder durch metabolische Kennzeichnung von Zellen mit radioaktiven Phosphate.

Abgesehen von der Verwendung von preiswerten P-Tag Acrylamid und einige geringfügigen Änderungen mit sich bringen folgt das vorliegende Verfahren zur Erkennung von Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 ein allgemeines Protokolls Immunoblotting.Daher sollte es unkompliziert und leicht ausführbare in jedem Labor sein, wo Immunoblotting eine übliche Praxis, mit allen Arten von Proben ist, einschließlich der gereinigten Proteine, Zelle Lysates und Gewebe Homogenates.

Protocol

(1) Probenvorbereitung für die P-Tag SDS-PAGE Entfernen Sie und entsorgen Sie die Medien aus 10 cm Gerichte, in denen Zellen angebaut werden mit einer Absaugung, waschen Sie Zellen mit 5 mL Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) durch die erste Zugabe DPBS auf die Seite der Gerichte um nicht zu stören die Zellschicht und manuell rocken Sie die Gerichte zurück und her mehrere Male. Entfernen Sie und entsorgen Sie des DPBS mit einer Absaugung fügen Sie 2 mL von 0,25 % (w/V) Trypsin in…

Representative Results

Überexpression System: Phosphorylierung des HA-Rab10 von 3 Zellen × Fahne-LRRK2 in HEK293: HEK293 Zellen wurden mit 0,266 µg von HA-Rab10 Wildtyp und 1.066 µg von 3 × Flagge LRRK2 (Wildtyp, Kinase-inaktive Mutant (K1906M) oder FPD Mutanten) transfiziert. Rab10 Phosphorylierung wurde geprüft durch P-Tag SDS-PAGE gefolgt von Immunoblotting mit einem Anti-HA Antikörper (Abbildung 2). 10 µg Protein…

Discussion

Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Methode zum Nachweis Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 auf endogene Ebenen basierend auf der P-Tag-Methode. Da die derzeit verfügbaren Antikörper gegen phosphorylierten Rab10 nur mit überexprimieren Proteine¹⁵arbeitet, ist das vorliegende Verfahren unter Verwendung von P-Tag SDS-PAGE die einzige Möglichkeit, endogene Ebenen der Rab10 Phosphorylierung zu beurteilen. Darüber hinaus erlaubt das vorliegende Verfahren die Schätzung der Stöchiometrie …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität von Tokyo, Japan) freundlicherweise dafür die Plasmiden Codierung 3xFLAG LRRK2 WT und Mutanten. Wir danken auch Dr. Dario Alessi (Universität von Dundee, UK) freundlicherweise zur MLi-2 und das Plasmid Codierung HA-Rab10. Diese Arbeit wurde von der Japan Society für Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Anzahl JP17K08265 (G.I) unterstützt.

Materials

Reagents
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	homemade		150 mM NaCl, 8 mM Na₂HPO₄-12H₂O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄in MilliQ water and sterilized by autoclaving
Sodium chloride	Nacalai Tesque	31320-34
Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water	Wako	196-02835
Potassium chloride	Wako	163-03545
Potassium Dihydrogen Phosphate	Wako	169-04245
2.5% Trypsin (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Fetal bovine serum	BioWest	S1560	Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Sodium hydroxide	Wako	198-13765
Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH
Dimethyl sulfoxide	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Hydrochloric acid	Wako	080-01066
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	Wako	160-24751	Equivalent to Triton X-100
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Wako	346-01312
Sodium orthovanadate(V)	Wako	198-09752
Sodium fluoride	Kanto Chemical	37174-20
β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate	Nacalai Tesque	17103-82
Sodium pyrophosphate decahydrate	Kokusan Chemical	2113899
Microcystin-LR	Wako	136-12241
Sucrose	Wako	196-00015
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23200
Sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31607-65
Glycerol	Wako	075-00616
Bromophenol blue	Wako	021-02911
β-mercaptoethanol	Kanto Chemical	25099-00
Ethanol	Wako	056-06967
Methanol	Wako	136-01837
Phosphate-binding tag acrylamide	Wako	AAL-107	P-tag acrylamide
40% (w/v) acrylamide solution	Nacalai Tesque	06119-45	Acrylamide:Bis = 29:1
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
Ammonium persulfate (APS)	Wako	016-08021	10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water
2-propanol	Wako	166-04831
Manganese chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Molecular weight marker used in the protocol
WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	Nitrocellulose membrane
Durapore Membrane Filter	EMD Millipore	GVHP00010	PVDF membrane
Filter Papers No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Acetic acid	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	polyoxyethylenesorbitan monolaurate
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Wako	345-01865
Skim milk powder	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	ECL solution (Normal sensitivity)
Immunostar LD	Wako	290-69904	ECL solution (High sensitivity)
CBB staining solution	homemade		1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water
CBB R-250	Wako	031-17922
CBB destaining solution	homemade		12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
anti-HA antibody	Sigma-Aldrich	11583816001	Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting.
anti-Rab10 antibody	Cell Signaling Technology	#8127	Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.
anti-pSer935 antibody	Abcam	ab133450	Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-LRRK2 antibody	Abcam	ab133518	Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-α-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T9026	Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-GAPDH antibody	Santa-Cruz	sc-32233	Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhibitors
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
MLi-2	Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)		Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)		This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CO₂ incubator	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110 Water-Jacketed
Auto Pipette	Drummond	Pipet-Aid PA-400
Micropipette P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5–10 μL
Micropipette P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20–200 μL
Micropipette P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100–1000 μL
Tips for micropipette P10	STAR	RST-481LCRST	Sterile
Tips for micropipette P200	FUKAEKASEI	1201-705YS	Sterile
Tips for micropipette P1000	STAR	RST-4810BRST	Sterile
5 mL disporsable pipette	Greiner	606180	Sterile
10 mL disporsable pipette	Greiner	607180	Sterile
25 mL disporsable pipette	Falcon	357535	Sterile
Hematocytometer	Sunlead Glass	A126	Improved Neubeuer
Microscope	Olympus	CKX53
10 cm dishes	Falcon	353003	For tissue culture
6-well plates	AGC Techno Glass	3810-006	For tissue culture
Vortex mixer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
Cell scrapers	Sumitomo Bakelite	MS-93100
1.5 mL tubes	STAR	RSV-MTT1.5
15 mL tubes	AGC Techno Glass	2323-015
50 mL tubes	AGC Techno Glass	2343-050
Centrifuges	TOMY	MX-307
96-well plates	Greiner	655061	Not for tissue culture
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS–PAGE tanks	Nihon Eido	NA-1010
Transfer tanks	Nihon Eido	NA-1510B
Gel plates (notched)	Nihon Eido	NA-1000-1
Gel plates (plain)	Nihon Eido	NA-1000-2
Silicon spacers	Nihon Eido	NA-1000-16
17-well combs	Nihon Eido	Custom made
Binder clips	Nihon Eido	NA-1000-15
5 mL syringe	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Power Station 1000 VC	ATTO	AE-8450	Power supply for SDS–PAGE and transfer
Large weighing boats	Ina Optika	AS-DL
Plastic containers	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
Rocking shaker	Titech	NR-10
Styrene foam box	generic		The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL

References

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Ito, G., Tomita, T. Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag. J. Vis. Exp. (130), e56688, doi:10.3791/56688 (2017).