एसडीएस-पृष्ठ के साथ एक फॉस्फेट-बाइंडिंग टैग का उपयोग करके LRRK2 गतिविधि द्वारा फास्फारिलीकरण डिटेक्शन Rab10
Summary
वर्तमान अध्ययन leucine-रिच दोहराने कळेनासे 2 द्वारा Rab10 फास्फारिलीकरण के अंतर्जात स्तर का पता लगाने की एक सरल विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
leucine-रिच दोहराने कळेनासे 2 (LRRK2) में उत्परिवर्तनों को पारिवारिक पार्किंसंस रोग (FPD) के साथ जोड़ा जा करने के लिए दिखाया गया है । LRRK2 की कळेनासे गतिविधि के असामान्य सक्रियण पीडी के रोगजनन में फंसाया गया है के बाद से, यह LRRK2 की कळेनासे गतिविधि के शारीरिक स्तर का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि स्थापित करने के लिए आवश्यक है. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि LRRK2 ऄब GTPase परिवार के phosphorylates सदस्य, जिनमें Rab10 है, शारीरिक दशाओं के अंतर्गत । हालांकि अंतर्जात Rab10 के फास्फारिलीकरण में LRRK2 द्वारा जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है, यह गया है के लिए immunoblotting द्वारा यह पता लगाने के लिए मुश्किल है वर्तमान में उपलब्ध फास्फारिलीकरण के गरीब संवेदनशीलता के कारण-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए Rab10 । यहां, हम LRRK2 द्वारा immunoblotting उपयोग सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) एक फॉस्फेट बाध्यकारी टैग (पी टैग) के साथ संयुक्त के आधार पर Rab10 फास्फारिलीकरण के अंतर्जात स्तर का पता लगाने की एक सरल विधि का वर्णन है, जो है n-(5-(2-aminoethylcarbamoyl) pyridin-2-ylmetyl)-n,n ‘,n ‘-tris (pyridin-2-yl-मिथाइल)-1, 3-diaminopropan-2-राजभाषा । वर्तमान प्रोटोकॉल न केवल पी-टैग का उपयोग पद्धति का एक उदाहरण प्रदान करता है, लेकिन यह भी कैसे उत्परिवर्तनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अवरोधक उपचार/प्रशासन या किसी अंय कारकों के आकलन में सक्षम बनाता है कोशिकाओं और ऊतकों में LRRK2 के बहाव संकेतन बदल .
Introduction
पीडी सबसे आम neurodegenerative रोगों में से एक है, मुख्य रूप से midbrain में dopaminergic ंयूरॉंस को प्रभावित करने, बुजुर्ग लोगों में मोटर प्रणालियों की शिथिलता में जिसके परिणामस्वरूप1। जहां ज्यादातर मरीज छिटपुट तरीके से पीडी का विकास करते हैं, वहीं परिवार इस बीमारी को विरासत में प्राप्त कर रहे हैं । कई जीन में उत्परिवर्तनों को FPD2के साथ जोड़ा जा पाया है । FPD के लिए करणीय जीन में से एक LRRK2 है, जिसमें आठ अर्थपूर्ण उत्परिवर्तन (N1437H, R1441C/जी/एच/एस, Y1699C, G2019S, और I2020T) से जुड़े एक प्रमुख रूप से विरासत में मिली FPD कहा जाता है PARK8 अब तक3,4,5बताया गया है । छिटपुट पीडी रोगियों के कई जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (GWAS) भी पीडी के लिए एक जोखिम कारक के रूप में LRRK2 लोकस में जीनोमिक रूपांतरों की पहचान की है, सुझाव है कि LRRK2 के समारोह में विषमता दोनों छिटपुट में neurodegeneration का एक आम कारण है और PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 एक बड़ा प्रोटीन (२,५२७ अमीनो एसिड) एक leucine-रिच दोहराने डोमेन, जटिल प्रोटीन (ROC) डोमेन, एक सी ROC के टर्मिनल (ï) डोमेन, एक serine/threonine प्रोटीन कळेनासे डोमेन, और एक WD40 दोहराने डोमेन9के एक GTP बाध्यकारी रास से मिलकर है । आठ FPD उत्परिवर्तनों इन कार्यात्मक डोमेन में पता लगाने; N1437H और R1441C/G/H/S ROC डोमेन में, Y1699C ï डोमेन में, G2019S और I2020T में कळेनासे डोमेन । G2019S उत्परिवर्तन, जो पीडी रोगियों में सबसे अधिक बार पाया उत्परिवर्तन के बाद से10,11,12, 2-3 द्वारा LRRK2 के कळेनासे गतिविधि बढ़ जातीहै 13में गुना, यह कल्पना की है कि LRRK2 सब्सट्रेट (ओं) के फास्फारिलीकरण में असामान्य वृद्धि न्यूरॉन्स के लिए विषाक्त है. हालांकि, यह अध्ययन करने के लिए असंभव हो गया है कि शारीरिक रूप से प्रासंगिक LRRK2 सब्सट्रेट के फास्फारिलीकरण रोगी व्युत्पंन नमूनों में यह मूल्यांकन विधियों की कमी के कारण पारिवारिक/छिटपुट पीडी रोगियों में बदल गया है ।
प्रोटीन फास्फारिलीकरण आम तौर पर immunoblotting या एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) एंटीबॉडी का उपयोग विशेष रूप से प्रोटीन के phosphorylated राज्य को पहचानने या जन spectrometric विश्लेषण द्वारा पता चला है । हालांकि, पूर्व रणनीति फास्फारिलीकरण-विशिष्ट एंटीबॉडी बनाने में कठिनाइयों की वजह से कभी नहीं लागू किया जा सकता है । रेडियोधर्मी फॉस्फेट के साथ कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग फास्फारिलीकरण-विशिष्ट एंटीबॉडी आसानी से उपलब्ध नहीं हैं जब फास्फारिलीकरण के शारीरिक स्तर की जाँच करने के लिए एक और विकल्प है. हालांकि, यह रेडियोधर्मी सामग्री की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है और इसलिए radioprotection14के लिए कुछ विशेष उपकरण शामिल है । मास spectrometric विश्लेषण इन immunochemical विधियों की तुलना में अधिक संवेदनशील होता है और प्रोटीन फास्फारिलीकरण का विश्लेषण करने में लोकप्रिय हो गया. हालांकि, नमूना तैयारी समय लेने वाली है, और महंगे उपकरणों के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं ।
Rab10 और Rab8 सहित ऄब GTPase परिवार का एक सबसेट हाल ही में एक बड़े पैमाने पर phosphoproteomic विश्लेषण के परिणाम के आधार पर LRRK2 के लिए प्रत्यक्ष शारीरिक सब्सट्रेट के रूप में सूचित किया गया था15. हम तो प्रदर्शन किया है कि Rab10 फास्फारिलीकरण माउस भ्रूण fibroblasts में FPD उत्परिवर्तनों और knockin चूहों के फेफड़ों में बढ़ गया था16। इस रिपोर्ट में, हम एक सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ)-आधारित विधि है जिसमें एक पी टैग अणु एसडीएस में सह-बहुलक है-पृष्ठ जैल (पी टैग एसडीएस-पृष्ठ) अंतर्जात Rab10 के फास्फारिलीकरण स्तर का पता लगाने के लिए चुना है, क्योंकि phosphorylated Rab10 के लिए एक अति संवेदनशील एंटीबॉडी का अभी भी अभाव था. हम कुल Rab8 के लए वर्तमान में उपलब्ध एंटीबॉडी के गरीब selectivity के कारण अंतर्जात Rab8 के फास्फारिलीकरण का पता लगाने में असफल रहे हैं. इसलिए, हम Rab10 फास्फारिलीकरण पर ध्यान केंद्रित करने का फैसला किया । LRRK2 phosphorylates उच्च संरक्षित “स्विच द्वितीय” क्षेत्र के बीच में पता लगाने Thr73 पर Rab10 । ऄब प्रोटीन के बीच फास्फारिलीकरण साइटों के उच्च संरक्षण कारणों में से एक हो सकता है क्यों phosphospecific एंटीबॉडी पहचानने विशिष्ट ऄब प्रोटीन बनाने के लिए मुश्किल हैं ।
LRRK2 द्वारा Rab8A के फास्फारिलीकरण Rabin8, एक guanine न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर (जीईएफ) जो Rab8A15के साथ बाध्य सकल घरेलू उत्पाद का आदान प्रदान द्वारा GTP सक्रिय करता है की बाध्यकारी रोकता है । LRRK2 द्वारा Rab10 और Rab8A की फास्फारिलीकरण भी सकल घरेलू उत्पाद-पृथक्करण अवरोधकों (GDIs) के बंधन को रोकती है, जो घरेलू उत्पाद-बाउंड ऄब प्रोटीन को झिल्ली से बाहर निकालकर ऄब प्रोटीन के सक्रियण के लिए जरूरी हैं । सामूहिक, यह कल्पना की है कि LRRK2 द्वारा ऄब प्रोटीन की फास्फारिलीकरण उंहें सक्रियण से रोकता है, हालांकि सटीक आणविक तंत्र और फास्फारिलीकरण के शारीरिक परिणाम अस्पष्ट रहते हैं ।
p-टैग एसडीएस-पृष्ठ Kinoshita एट अल द्वारा आविष्कार किया गया था । २००६ में: इस विधि में, acrylamide पी के साथ मिलकर covalently था, एक अणु उच्च समानता है, जो copolymerized में एसडीएस-पेज जैल17के साथ फॉस्फेट पर कब्जा । क्योंकि पी टैग एक एसडीएस में अणुओं-पृष्ठ जेल चुनिंदा मंदबुद्धि phosphorylated प्रोटीन के electrophoretic गतिशीलता, पी टैग एसडीएस-पृष्ठ गैर phosphorylated लोगों से phosphorylated प्रोटीन अलग कर सकते है (चित्रा 1) । यदि प्रोटीन के हित के कई अवशेषों पर phosphorylated है, बैंड की एक सीढ़ी विभेदक phosphorylated रूपों के लिए इसी मनाया जाएगा । Rab10 के मामले में, हम केवल एक स्थानांतरित बैंड का निरीक्षण, यह दर्शाता है कि Rab10 केवल Thr73 पर phosphorylated है । पी के प्रमुख लाभ-टैग एसडीएस-फास्फारिलीकरण-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunoblotting से अधिक पृष्ठ है कि phosphorylated Rab10 गैर immunoblotting-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ फास्फारिलीकरण द्वारा पता लगाया जा सकता है (यानी, पहचानने कुल Rab10) झिल्ली पर स्थानांतरित किया जा रहा है, जो आम तौर पर अधिक विशिष्ट है के बाद, संवेदनशील, और वाणिज्यिक/ पी टैग एसडीएस-पृष्ठ का उपयोग कर का एक और लाभ यह है कि एक फास्फारिलीकरण के stoichiometry के अनुमानित अनुमान प्राप्त कर सकते हैं, जो फास्फारिलीकरण के साथ immunoblotting द्वारा असंभव है-विशिष्ट एंटीबॉडी या रेडियोधर्मी के साथ कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग द्वारा फॉस्फेट.
इसके अलावा सस्ती पी के उपयोग के टैग acrylamide और कुछ मामूली संशोधन से संबंधित है, LRRK2 द्वारा Rab10 फास्फारिलीकरण का पता लगाने के लिए वर्तमान विधि immunoblotting के एक सामांय प्रोटोकॉल निंनानुसार है ।इसलिए, यह सीधा और आसानी से किसी भी प्रयोगशालाओं जहां immunoblotting एक सामांय अभ्यास है में निष्पादन योग्य होना चाहिए, के नमूनों के किसी भी प्रकार के साथ शुद्ध प्रोटीन, सेल lysates, और ऊतक homogenates सहित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम पी-टैग पद्धति के आधार पर अंतर्जात स्तरों पर LRRK2 द्वारा Rab10 फास्फारिलीकरण का पता लगाने की एक सतही और सुदृढ़ विधि का वर्णन करते हैं. क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध एंटीबॉडी phosphorylated Rab10 के खिलाफ ही से व्यक्त…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Dr. Takeshi Iwatsubo (टोक्यो विश्वविद्यालय, जापान) कृपया plasmids एंकोडिंग 3xFLAG-LRRK2 WT और म्यूटेंट प्रदान करने के लिए धंयवाद । हम भी कृपया MLi-2 और प्लाज्मिड एंकोडिंग हा-Rab10 प्रदान करने के लिए Dr. Dario एलएससी (डंडी विश्वविद्यालय, यूके) के लिए धंयवाद । इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (JSPS) KAKENHI ग्रांट नंबर JP17K08265 (सैनिक) ने समर्थन दिया था ।
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
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