Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg
Summary
Föreliggande studie beskriver en enkel metod för att upptäcka endogena nivåerna av Rab10 fosforylering av leucin-rika upprepa kinase 2.
Abstract
Mutationer i leucin-rika upprepa kinase 2 (LRRK2) har visat sig vara kopplad till familjär Parkinsons sjukdom (FPD). Eftersom onormal aktivering av Kinas aktiviteten av LRRK2 har varit inblandade i patogenesen av PD, är det viktigt att fastställa en metod för att utvärdera de fysiologiska nivåerna av kreatinkinas aktiviteten av LRRK2. Senare studier visade att LRRK2 phosphorylates Rab GTPase familjemedlemmar, inklusive Rab10, under fysiologiska betingelser. Även om fosforyleringen av endogena Rab10 av LRRK2 i odlade celler kunde ha upptäckts av masspektrometri, har det varit svårt att upptäcka det av immunoblotting på grund av dålig känslighet av för närvarande tillgängliga fosforylering-specifika antikroppar för Rab10. Här, vi beskriver en enkel metod för att upptäcka de endogena nivåerna av Rab10 fosforylering av LRRK2 baserat på immunoblotting utnyttja sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) i kombination med en fosfat-bindande taggen (P-taggen), som är N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) –N,N’,N’– tris (pyridin-2-yl-metyl) – 1,3 – diaminopropan-2-ol. Detta protokoll inte bara innehåller ett exempel på den metod som utnyttjar den P-tag men gör också att bedömningen av hur mutationer samt hämmare behandling/administration eller andra faktorer förändrar de nedströms signalering av LRRK2 i celler och vävnader .
Introduction
PD är en av de vanligaste neurodegenerativa sjukdomarna, huvudsakligen påverkar dopaminerga nervceller i mellanhjärnan, vilket resulterar i dysfunktion av de motoriska system i äldre1. Medan de flesta patienter utvecklar PD en sporadisk sätt, finns det familjer ärva sjukdomen. Mutationer i flera gener har hittats kopplas med FPD2. En av orsakande gener för FPD är LRRK2, där åtta missense mutationer (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S och I2020T) kopplad till en dominant ärftlig FPD kallas PARK8 hittills varit rapporterade3,4,5. Flera genome-wide associationsstudier (GWAS) av sporadiska PD patienter har också identifierat genetiska variationer på det LRRK2 locus som en riskfaktor för PD, tyder på att abnormitet i fungera av LRRK2 är en vanlig orsak till neurodegeneration i både sporadiska och PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 är ett stort protein (2 527 aminosyror) som består av en leucin-rika upprepa domän, en GTP-bindande Ras av komplexa proteiner (ROC) domän, en C-terminal ROC (ReK) domän, en serin/treonin protein kinase domän och en WD40 upprepa domän9. De åtta FPD-mutationerna lokalisera i dessa funktionella domäner; N1437H och R1441C/G/H/S i domänen ROC, Y1699C i domänen ReK, G2019S och I2020T i domänen tyrosinkinashämmare. Eftersom G2019S mutation, som är de vanligaste mutationen i PD patienter10,11,12, ökar kinase aktiviteten av LRRK2 av 2-3 gånger i vitro13, det är en hypotes om att den onormala ökningen av fosforylering av LRRK2 substrate(s) är giftigt för nervceller. Det har dock varit omöjligt att undersöka om fosforyleringen av fysiologiskt relevanta LRRK2 substrat ändras i familjär/sporadiska PD patienter på grund av metoder utvärdera det i härledda patientprover.
Protein fosforylering är allmänt identifieras av immunoblotting eller enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) med hjälp av antikroppar specifikt erkänner tillståndet fosforyleras proteiner eller genom massa spektrometriska analys. Dock kan den tidigare strategin ibland inte tillämpas på grund av svårigheter att skapa fosforylering-specifika antikroppar. Metaboliska märkning av celler med radioaktiva fosfat är ett annat alternativ att undersöka fysiologiska nivåer av fosforylering när fosforylering-specifika antikroppar inte är lätt tillgängliga. Men det kräver en stor mängd radioaktivt material och därför innebär vissa specialutrustning för strålskyddet14. Massa spektrometriska analys är känsligare jämfört dessa immunokemisk metoder och blev populär i analysera protein fosforylering. Dock provberedningen är tidskrävande och dyra instrument krävs för analysen.
En delmängd av Rab GTPase familjen inklusive Rab10 och Rab8 var nyligen rapporterat som direkta fysiologiska substrat för LRRK2 baserat på resultatet av en storskalig phosphoproteomic analys15. Vi visade sedan att Rab10 fosforylering ökade FPD mutationer i mus embryonala fibroblaster och i lungorna av knockin möss16. I detta betänkande, vi valde att anställa en sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE)-baserad metod där en P-taggen molekyl är samtidig polymeriserat i SDS-PAGE geler (P-taggen SDS-PAGE) för att upptäcka de endogena nivåerna av Rab10 fosforylering, eftersom en mycket känslig antikropp som är specifik för fosforylerade Rab10 saknades fortfarande. Vi har inte lyckats upptäcka fosforyleringen av endogena Rab8 på grund av dålig selektivitet av för närvarande tillgängliga antikroppar för totala Rab8. Därför har vi beslutat att fokusera på Rab10 phosphorylationen. LRRK2 phosphorylates Rab10 i Thr73 att hitta i mitten av regionen mycket ”växla II”. Höga naturvärden av fosforylering platser bland Rab proteiner kan vara en av anledningarna till varför phosphospecific antikroppar erkänner distinkta Rab proteiner är svåra att göra.
Fosforyleringen av Rab8A av LRRK2 hämmar bindningen av Rabin8, en guanin nukleotid exchange faktor (GEF) som aktiverar Rab8A genom att utbyta bundna BNP med GTP15. Fosforylering av Rab10 och Rab8A av LRRK2 också hämmar bindningen av BNP-dissociation-hämmare (GDIs), som är avgörande för aktiveringen av Rab proteiner genom att extrahera BNP-bundna Rab proteiner från membran15. Sammantaget är det en hypotes om att fosforyleringen av Rab proteiner av LRRK2 hindrar dem från att aktivering även om de exakta molekylära mekanismen och fysiologiska konsekvenser av fosforyleringen förblir oklart.
P-taggen SDS-PAGE uppfanns av Kinoshita et al. 2006: I den här metoden var akrylamid kovalent tillsammans med P-taggen, en molekyl som fånga fosfater med hög affinitet, vilket copolymerized i SDS-PAGE geler17. Eftersom P-taggen molekylerna i en SDS-PAGE gel selektivt fördröja elektroforetiska mobilitet av fosforyleras proteiner, P-taggen SDS-PAGE kan separera fosforyleras proteiner från de icke-fosforyleras (figur 1). Om de protein-of-intressen är fosforyleras på flera rester, kommer en stege av band som motsvarar differentially fosforyleras former att iakttas. När det gäller Rab10 observerar vi bara ett skiftat band, vilket indikerar att Rab10 är fosforyleras endast på Thr73. Den stora fördelen med P-taggen SDS-PAGE över immunoblotting med fosforylering-specifika antikroppar är att fosforyleras Rab10 kan upptäckas av immunoblotting med icke-fosforylering-specifika antikroppar (dvsigenkännande totala Rab10) efter överförs på membran, som är generellt mer särskilda, känsliga och tillgänglig från kommersiella/akademiska källor. En annan fördel med att använda P-taggen SDS-PAGE är att man kan få ungefärlig uppskattning av stökiometri av fosforylering, som är omöjligt av immunoblotting med fosforylering-specifika antikroppar eller metabola märkning av celler med radioaktivt fosfater.
Förutom användningen av billiga P-taggen akrylamid och några mindre modifieringar som anknyter till det, följer denna metod för detektion av Rab10 fosforylering av LRRK2 en allmän protokollet av immunoblotting.Det bör därför enkel och lätt körbar i alla laboratorier där immunoblotting är en vanlig praxis, med alla typer av prover inklusive renade proteiner, cell lysates och vävnad homogenates.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en lättköpt och robust metod för att upptäcka Rab10 fosforylering av LRRK2 på endogena nivåer baserat på metoden som P-taggen. Eftersom den för närvarande tillgängliga antikroppen mot fosforylerade Rab10 fungerar endast med överuttryckt proteiner15, är den nuvarande metoden utnyttja P-taggen SDS-PAGE det enda sättet att bedöma endogena nivåerna av Rab10 fosforylering. Dessutom tillåter denna metod uppskattning av stökiometri av Rab10 fosforylering i celler. Efter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo, Japan) för vänligt att ge plasmidsna kodning 3xFLAG-LRRK2 WT och mutanter. Vi tackar också Dr Dario Alessi (universitetet i Dundee, UK) Vänligen förse MLi-2 och plasmiden kodning HA-Rab10. Detta arbete stöds av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI Grant nummer JP17K08265 (G.I.).
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson’s disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson’s disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson’s disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson’s Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson’s disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson’s disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
