Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

Summary

Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.

Abstract

Cel en genetische therapie zijn spannende en veelbelovende strategieën met het oog op cardiale regeneratie in de omgeving van hartfalen met verminderd ejectie fractie (HFrEF). Voordat ze kunnen worden beschouwd voor gebruik en ten uitvoer gelegd bij de mens, zijn uitgebreide Preklinische studies verplicht in grote diermodellen te evalueren van de veiligheid, werkzaamheid, en het lot van de injectate (b.v., stamcellen) eenmaal in het myocardium overgeleverd. Kleine knaagdieren modellen bieden voordelen (bijvoorbeeld, kosteneffectiviteit, inschikkelijkheid voor genetische manipulatie); echter, gezien de inherente beperkingen van deze modellen, de bevindingen in dit zelden vertalen naar de kliniek. Omgekeerd, grote dierlijke modellen zoals konijnen, hebben voordelen (bijvoorbeeld, soortgelijke cardiale electrofysiologie t.o.v. mensen en andere grote dieren), met behoud van een goede kosteneffectieve balans. Hier, we laten zien hoe u kunt uitvoeren een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie (IMI) techniek, die minimaal invasieve, veilig, goed getolereerd, zeer effectief zijn in de beoogde levering van injectates en, met inbegrip van cellen, op verschillende locaties binnen het myocardium van een konijn-model. Voor de uitvoering van deze techniek, hebben wij ook geprofiteerd van een algemeen beschikbare klinische echocardiografie systeem. Na de invoering in de praktijk het protocol hier beschreven, een onderzoeker met fundamentele echografie kennis zal worden bevoegd zijn op de prestaties van deze veelzijdige en minimaal invasieve techniek voor routinematig gebruik in experimenten, gericht op de hypothese testen van de mogelijkheden van cardiale regeneratieve therapeutics in het konijn-model. Zodra competentie is bereikt, kan de hele procedure kan worden uitgevoerd binnen 25 minuten na het konijn te verdoven.

Introduction

Cel en gen-therapieën zijn spannend en ooit het uitwerken van strategieën voor het regenereren/repareren van de gewonde myocard in HFrEF. Een paar studies vergeleken de effectiviteit (b.v., cel retentie tarief) van de verschillende routes van cel levering, die consequent is gebleken dat de superioriteit van IMI over intracoronary of intraveneuze routes^{1,2 , 3 , 4 , 5}. het is dus niet verwonderlijk dat een groot aantal studies over translationeel modellen van stamcel therapie van de gewonde myocard, leveren de injectate via het IIM uitgevoerd onder directe weergave in een open borst procedure^6,7 . Deze benadering heeft echter verschillende beperkingen, met inbegrip van het invasieve karakter van de procedure, die het risico van peri-procedurele sterfte (vaak onder-gerapporteerd)^{8 draagt}. Daarnaast elimineert een IMI onder direct zicht niet de mogelijkheid voor onbedoelde injectie in de ventriculaire holte. In de klinische praktijk kan een IMI tijdens open borst chirurgie een geschikte methode voor therapeutische cel levering, bijvoorbeeld, tijdens de coronaire bypassoperatie graft (CABG); echter, deze aanpak mogelijk niet geschikt is voor de levering van de cel in global cardiomyopathie van niet-ischemische herkomst (b.v.HFrEF ondergeschikt aan anthracycline-geïnduceerde cardiomyopathie (AICM)).

Er is geen twijfel dat de ischemische hartziekte (IHD) is de meest voorkomende oorzaak van HFrEF (~ 66%)^9,10; echter niet-ischemische cardiomyopathie, met inbegrip van AICM, geldt nog steeds een aanzienlijk deel van de patiënten met HFrEF (33%)⁹ . Inderdaad, de recente vooruitgang in klinische oncologie hebben geresulteerd in meer dan 10 miljoen overlevenden van kanker in de VS alleen al¹¹, met schattingen van een vergelijkbaar aantal in Europa, consistent met een algemene trend naar betere overleving van kankerpatiënten^{12 ,},¹³. Dus, het verkennen van de voordelen van nieuwe therapieën, zoals stamcel transplantatie voor niet-ischemische cardiomyopathie, evenals de trialing van een doeltreffende en minimaal invasieve route van levering van de cel van de stam is van het allergrootste belang, gezien het toenemende aantal patiënten beïnvloed door cardiotoxicity ondergeschikt aan geneesmiddelen tegen kanker.

Van de nota impliceert hypothese testen studies met stamcel therapie gericht op het herstellen/regenereren de gewonde myocard vaak het gebruik van kleine knaagdieren (b.v., muizen en ratten). Deze modellen vereisen vaak dure hoogfrequente ultrasone systemen voor evaluatie van myocardiale functie, meestal uitgerust met lineaire matrix omvormers hebben sommige inherente bijbehorende beperkingen (bv, galm)¹⁴. Andere modellen zoals konijnen, dat een grote preklinische model, echter sommige voordelen voor hypothese testen van stamcellen therapieën in HFrEF. Dus, in tegenstelling tot de ratten en muizen, konijnen houden een Ca^{+ 2} vervoerssysteem en cellulaire electrofysiologie die lijkt op die van de mens en andere grote dieren (bijvoorbeeld, honden en varkens)^{15,16,17 ,18,19}. Een ander voordeel, is hun inschikkelijkheid voor cardiale echografie beeldvorming met behulp van relatief goedkoop en overal verkrijgbaar klinische echocardiografie systemen uitgerust met relatief hoge frequentie fase matrix omvormers, bijvoorbeeld, 12 MHz, zoals die veelvuldig worden gebruikt bij Neonatale en pediatrische cardiologie. Deze systemen kunnen uitstekende echocardiographic beeldbewerking met state of the art technologie en zij profiteren van de superioriteit van harmonic imaging²⁰. Bovendien uitgebreide hypothese testen van het potentieel van cardiale regeneratieve therapie (b.v., stamcel therapie), hun veiligheid, werkzaamheid, cardiomyogenic potentieel, alsmede evaluatie van het lot van de injectate eenmaal afgeleverd in de myocard, is verplicht, voordat ze voor menselijk gebruik kunnen worden beschouwd, en ze vereisen het gebruik van grote preklinische diermodellen, zoals het konijn^17,19. Hier beschrijven we een minimaal invasieve techniek voor cel levering via percutane contrast-echocardiografie begeleide IMI een klinische echocardiografie-systeem, dat is gericht op stamcel transplantatie gebaseerde therapie voor niet-ischemische cardiomyopathie²⁰ . Ook beschrijven we de voordelen van de Oost-Indische inkt (InI, ook bekend als China inkt) als een echografie contrast agent en in situ tracer van de injectate in het hart van het konijn.

Protocol

De experimenten die hierin worden beschreven werden goedgekeurd door de ethische commissie van het onderzoek van de Universiteit van Murcia, Spanje, en werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EG van de EuropeseCommissie. De stappen die beschreven werden uitgevoerd onder operationele standaardprotocollen die deel uitmaakten van het werkplan en niet uitsluitend met het oog op het filmen van de begeleidende video op dit papier zijn uitgevoerd. 1. bereiding van de cellen en zoogdieren exp…

Representative Results

Percutane Contrast echocardiografie geleide IMI met InI: Hierboven beschreven met behulp van het protocol, en zodra de optimale positionering van de punt van de naald werd bevestigd door echocardiografie en de injectie gestart, transmurale hyperechogenicity werd waargenomen tijdens de levering van InI (10% v/v in PBS) (figuur 2E) , ook zo kort na het IMI aan de target-regio (<strong…

Discussion

Het primaire doel was het ontwikkelen van een minimaal invasieve techniek die worden voor de levering van stamcellen in het myocardium van konijnen (een groot formaat preklinische diermodel)^17,18, gebruikt kan terwijl profiteren van het gebruik van een relatief goedkoop imaging systeem beschikbaar in veel klinische en onderzoekscentra. Hier laten we zien dat met behulp van een systeem van klinische echocardiografie, en geholpen door InI, een algemeen beschikbare …

Materials

HD11 XE Ultrasound System	Philips	10670267	Echocardiography system.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe	Braun	9161406V
Imalgene (Ketamine)	Merial	RN 9767	Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	India (China) Ink
Holter Syneflash	Ela medical	SF0003044S	24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	Holter ECG electrodes.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
Microscope	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262	Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-9010	Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% fetal calf serum (FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Fisher Scientific	31985070
Hygromycin B	Calbiochem (MERCK)	400051
Xylene (histological)	Fisher Scientific	X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)	Sigma	H1009
Pronase	Fisher Scientific	53-702-250KU