Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Summary

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Abstract

Terapia celular e gene são emocionantes e reduziram de promissoras para efeitos de regeneração cardíaca no cenário de insuficiência cardíaca com fração de ejeção (HFrEF). Antes que possam ser considerados para uso e implementados nos seres humanos, estudos pré-clínicos extensivos são necessárias em grandes modelos animais para avaliar a segurança, eficácia e destino do injectate (por exemplo, as células-tronco), uma vez entregado para o miocárdio. Pequenos roedores modelos oferecem vantagens (por exemplo, custo-eficácia, acessibilidade para manipulação genética); no entanto, tendo em conta as limitações inerentes destes modelos, estas conclusões raramente traduzem para a clínica. Por outro lado, grandes modelos animais como coelhos, têm vantagens (por exemplo, eletrofisiologia cardíaca semelhante em relação aos seres humanos e outros animais de grandes porte), mantendo um bom equilíbrio de custo-benefício. Aqui, demonstramos como executar uma técnica de injeção (IMI) contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica, que é minimamente invasiva, segura, bem tolerada e muito eficaz na entrega alvo de injectates, incluindo as células, em vários locais dentro do miocárdio de um modelo de coelho. Para a execução desta técnica, podemos também aproveitaram de um sistema de ecocardiografia clínica amplamente disponível. Depois de colocar em prática o protocolo descrito aqui, um pesquisador com conhecimento básico de ultra-som irá tornar-se competente no desempenho desta técnica minimamente invasiva e versátil para uso rotineiro em experiências, destinadas a testes de hipóteses do capacidades de terapêuticas regenerativas cardíaca no modelo de coelho. Uma vez que a competência é alcançada, todo o processo pode ser realizado em 25 min depois anestesiando o coelho.

Introduction

Terapias celulares e gene são emocionantes e sempre desenvolvendo estratégias para a regeneração/reparação de miocárdio lesionado em HFrEF. Alguns estudos compararam a eficácia (por exemplo, taxa de retenção de célula) com as diferentes rotas de entrega de celular, que têm consistentemente demonstrado a superioridade do IMI sobre rotas Intracoronário ou intravenosa^{1,2 , 3 , 4 , 5}. assim, não é surpreendente que uma grande proporção de estudos sobre modelos translacionais de terapia com células estaminais do miocárdio lesionado, entregar o injectate através do IMI realizada sob visão direta em um peito aberto procedimento^6,7 . No entanto, esta abordagem tem várias limitações, incluindo a natureza invasiva do procedimento, que acarreta o risco de mortalidade peri-processuais (muitas vezes sob-relatado)⁸. Além disso, um IMI sob visão direta não elimina a possibilidade de injeção inadvertida na cavidade ventricular. Na prática clínica um IMI durante a cirurgia de peito aberto pode ser um método apropriado para a entrega de célula terapêutico, por exemplo, durante a artéria coronária ignorar a cirurgia de enxerto (CABG); no entanto, esta abordagem pode não ser apropriada para a entrega de célula na cardiomiopatia global de origem não-isquêmica (por exemplo, HFrEF secundária à cardiomiopatia induzida pelo regime (AICM)).

Não há dúvida que doença isquêmica do coração (IHD) é a causa mais comum de HFrEF (~ 66%)^9,10; no entanto, cardiomiopatia não-isquêmica, incluindo AICM, ainda afeta uma proporção significativa de pacientes com HFrEF (33%)⁹ . Com efeito, os avanços recentes em oncologia clínica resultaram em mais de 10 milhões de sobreviventes de câncer em os EUA sozinhos¹¹, com estimativas de um número similar na Europa, consistente com uma tendência geral para a sobrevivência melhorada de pacientes com câncer^{12 ,13}. Assim, explorando os benefícios da novela terapias tais como transplante de células estaminais para cardiomiopatia não-isquêmica, bem como a testagem de uma rota eficaz e minimamente invasiva de células-tronco de entrega é de extrema importância, dado o número crescente de pacientes afetados por cardiotoxicidade secundária a drogas anticâncer.

Digno de nota, estudos utilizando a terapia de células-tronco, com o objetivo de reparação/regenerar o miocárdio lesionado frequentemente de testes de hipóteses envolve o uso de pequenos roedores (por exemplo, ratos e ratazanas). Estes modelos, muitas vezes, exigem sistemas de ultra-som caro de alta frequência para avaliação da função miocárdica, geralmente equipada com transdutores de matriz linear que tem algumas limitações inerentes de associado (por exemplo, reverberação)¹⁴. No entanto, outros modelos tais como coelhos, representando uma grande maquete pré-clínicos, possuem algumas vantagens para testar a hipótese de terapias de células-tronco em HFrEF. Assim, em contraste com ratos e camundongos, coelhos mantêm um sistema de transporte do Ca^{+ 2} e Eletrofisiologia celular que se assemelha ao de seres humanos e outros animais de grande porte (por exemplo, cães e porcos)^{15,16,17 ,18,19}. Outra vantagem, é a sua acessibilidade para ultrassom cardíaco de imagem usando relativamente barato e sistemas amplamente disponível ecocardiografia clínica equipados com transdutores array fase relativamente alta frequência, por exemplo, 12 MHz, tais como aqueles usados frequentemente em Cardiologia Pediátrica e neonatal. Estes sistemas permitem excelente imagem ecocardiográfica com tecnologia de ponta, e eles se aproveitam da superioridade da harmônica de imagem²⁰. Além disso, testes de hipóteses extensa do potencial de terapias regenerativas cardíacas (por exemplo, terapia de células-tronco), sua segurança, eficácia, cardiomyogenic potencial, bem como avaliação do destino do injectate uma vez entregaram para o miocárdio, é obrigatório antes de eles podem ser considerados para uso humano, e eles exigem o uso de modelos animais pré-clínicos grandes, tais como o coelho^17,19. Aqui, descrevemos uma técnica minimamente invasiva para a entrega do celular através do IMI de contraste-ecocardiografia percutânea guiada usando um sistema de ecocardiografia clínica, que se destina na terapia baseada em transplante de células-tronco para cardiomiopatia não-isquêmica²⁰ . Descrevemos também os benefícios da tinta nanquim (InI, também conhecida como tinta de China) como um traçador ultra-som de agente e em situ de contraste da injectate no centro de coelho.

Protocol

Os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de ética pesquisa da Universidade de Múrcia, Espanha e foram realizados em conformidade com a Directiva 2010/63/UE da Comissão Europeia. As etapas descritas foram realizadas sob protocolos operacionais padrão que faziam parte do plano de trabalho e não tem sido realizados exclusivamente com o propósito de filmar o vídeo que acompanha este livro. 1. preparação de células e o vetor de expressão dos mamíferos <p class="jove…

Representative Results

IMI guiada por ecocardiografia com contraste percutânea com InI: Usando o protocolo descrito acima, e uma vez que o posicionamento ideal da ponta da agulha foi confirmado pela ecocardiografia e iniciada a injeção, transmural hyperechogenicity foi observada durante a entrega do InI (10% v/v na PBS) (Figura 2E) , bem como logo após o IMI para a região de destino (<strong class="x…

Discussion

O objetivo principal era desenvolver uma técnica minimamente invasiva que pode ser utilizada para a entrega de células-tronco em miocárdio de coelhos (um grande porte pré-clínicos modelo animal)^17,18, enquanto aproveitando-se da utilização de um relativamente barato prontamente disponível em muitas clínicas do sistema de imagem e centros de pesquisa. Aqui, mostramos que, usando um sistema de ecocardiografia clínica, e auxiliado por InI, um agente amplam…

Materials

HD11 XE Ultrasound System	Philips	10670267	Echocardiography system.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe	Braun	9161406V
Imalgene (Ketamine)	Merial	RN 9767	Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	India (China) Ink
Holter Syneflash	Ela medical	SF0003044S	24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	Holter ECG electrodes.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
Microscope	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262	Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-9010	Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% fetal calf serum (FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Fisher Scientific	31985070
Hygromycin B	Calbiochem (MERCK)	400051
Xylene (histological)	Fisher Scientific	X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)	Sigma	H1009
Pronase	Fisher Scientific	53-702-250KU