Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии
Summary
Клетки сетчатки пигментного эпителия могут служить клетки заместительная терапия для передовые формы сухие возраста макулярной дегенерации. Этот протокол описывает генерации большой eyed модель географической атрофии и субретинальное трансплантация человеческих эмбриональных стволовых клеток пигмента сетчатки эпителиальных клеток в этой модели болезни.
Abstract
Географической атрофии (GA), поздней стадии сухие возраста макулярной дегенерации характеризуется потерей сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) слоя, который приводит к последующим дегенерации жизненно сетчатки структур (например, фоторецепторов) вызывает тяжелые зрением. Аналогичным образом ПЭС потери и снижением остроты рассматривается в долгосрочной последующей вверх больных с передовых влажные возраста макулярной дегенерации (AMD) лечении интравитреальные анти Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Таким образом с одной стороны, это основополагающее значение для эффективного получения НПП клетки от неограниченный источник, который мог бы служить в качестве заместительной терапии. С другой стороны важно оценить поведение и интеграции производных ячеек в модели болезни, влекущие за собой хирургические и тепловизионные методы как можно ближе к те, которые применяются в организме человека. Здесь, мы предоставляем подробный протокол, основанный на наших предыдущих публикаций, описывающий поколения доклинических модели GA с использованием белых кролика глаза, для оценки человеческих эмбриональных стволовых клеток получены клетки сетчатки пигментного эпителия (Госкомсанэпиднадзором ПЭС) в клинически значимых параметр. Дифференцированные Госкомсанэпиднадзором НПП пересаживают в наивные глаза или глаза с NaIO3-индуцированной GA-как дегенерация сетчатки, используя технику plana Парс transvitreal 25 G. Оценку выродились и пересаженные областей осуществляется смешанных с высоким разрешением неинвазивные в реальном времени изображений.
Introduction
Этот протокол описывает поколения большой eyed доклинических модель географической атрофии (GA), которая позволяет оценить интеграции трансплантированных Госкомсанэпиднадзором-НПП в пространстве субретинальное. Здесь подробно описаны методы были использованы в 3 последних публикаций, которые демонстрируют производства обогащенного, чистый и функциональный населения НПП клеток с Госкомсанэпиднадзором1, а также создание внешнего повреждения сетчатки и фенотип GA-как индуцированных субретинальное инъекции физиологического солевых растворов (т.е., BSS и PBS) или3 NaIO в кролика глаза2,3. Далее мы продемонстрировали югу сетчатки подвеска трансплантации Госкомсанэпиднадзором-НПП образуют обширные функциональные монослои с фоторецепторных спасательных мощность2.
Несколько преимуществ сопровождать использование глаз кролика для поколения модели GA заболеваний. Во-первых размер кролика глаза, которая составляет 70% объема взрослого человеческого глаза, позволяет клинически значимого трансплантации используя плотность клеток, что намного ниже, чем обычно используется в небольших грызунов глаза (1000 клеток/мкл против 50 000 клеток/мкл)4 , 5. Во-вторых, хирургии в грызунов является обычно транссклеральная через хориоидея, который подрывает сетчатки барьер и потенциально вызывает воспалительной реакции и возможного отказа6. Оба этих фактора вместе может привести к multilayering и слипания пересаженные клетки и в целом плохой интеграции пересаженные клетки в нарушена родной ткани сетчатки. Однако большой eyed кролик модель позволяет выполнять хирургической техники с инструментированием идентичны в клинических условиях. В-третьих большими глазами модель также позволяет с высоким разрешением в vivo визуализации и мониторинга пересаженные клетки и вышележащих сетчатки через время1,2,3. Таким образом мы описываем клинически соответствующим и экономически эффективных доклинических модель, которая должна быть привлекательной альтернативой грызунов для тех, кто с интересом в исследованиях нормальных и больной сетчатки и югу сетчатки пространства.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описан поколения большой eyed модель GA и ее доклинических использования для оценки Госкомсанэпиднадзором НПП интеграции в естественных условиях .
Для перевода регенеративной терапии для GA и связанных с ними заболеваний в клинике7важно р…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантов из Каролинского института, кронпринцесса Margareta фонд для слепых, Эдвин иорданской для офтальмологических исследований, Шведский фонд глаз, Фонд короля Густава V, ARMEC Линдеберг фонд и Фонд Cronqvist.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
