En forbedret protokol præsenteres for måling af forbigående genekspression fra reporter konstruktioner i Byg aleurone celler efter partikel bombardement. Kombinationen af automatiserede korn slibning med 96 brønde plade enzym-assays giver høj overførselshastighed for proceduren.
Aleurone lag af Byg korn er en vigtig modelsystem for hormon-regulerede genekspression i planter. I aleurone celler, gener kræves for spiring eller tidlige sætteplante udvikling er aktiveret af gibberellin (GA), mens gener forbundet med stress svar er aktiveret af abscisic syre (ABA). Mekanismerne i GA og ABA signalering kan blive afhørt ved at indføre reporter gen konstruktioner i aleurone celler via partikel bombardement, med den deraf følgende forbigående udtryk målt ved hjælp af enzym-assays. En forbedret protokol er rapporteret som delvist automatiserer og strømliner korn homogenisering trin og enzym-assays, giver betydeligt mere hurtigere end eksisterende metoder. Homogenisering af korn prøver er udført ved hjælp af en automatiseret væv homogeniseringsapparat, og GUS (β-glucuronidasesystemer) assays udføres ved hjælp af en 96-brønd pladesystem. Repræsentative resultater ved hjælp af protokollen tyder på at fosfolipase D aktivitet kan spille en vigtig rolle i aktivering af HVA1 genekspression af ABA, gennem transkriptionsfaktor TaABF1.
Byg aleurone lag er en veletableret modelsystem for studiet af hormon-regulerede genekspression i planter1. Især aktiveres en række gener, der kræves til spiring eller tidlige sætteplante udvikling ved gibberellin (GA), mens gener forbundet med stress svar er aktiveret af abscisic syre (ABA). GA og ABA signalering veje er forbundet, som udtryk for nogle GA-aktiveret gener er hæmmet af ABA, og vice-versa1.
En værdifuld strategi for forståelse af særlige aktører i GA/ABA signalering rolle har været indførelsen af effektor gen konstruktioner via partikel bombardement, efterfulgt af forbigående udtryk for reporter konstruktioner, der giver den resulterende effekt på downstream genekspression skal fastlægges. Brug af reporter gener som GUS (β-glucuronidasesystemer) eller Luciferase tillader den følsomme og kvantitativ måling af genekspression specielt inden for de celler, der har modtaget effektor konstruktion. For eksempel, etableret indførelsen af en effektor konstruere kodning transkriptionsfaktor TaABF15,6 , at ABA-inducerede gener såsom HVA1 er induceret af TaABF1, mens GA-inducerede gener såsom Amy32b undertrykkes. Partikel bombardement som en eksperimentel strategi er blevet brugt af flere laboratorier til at undersøge forskellige aspekter af GA/ABA signalering. Dette arbejde har ført til identifikation af promotor elementer vigtig for aktivering af både GA-induceret2 og ABA-inducerede gener3og til opdagelsen af protein kinaser4 og transskription faktorer5 , der regulerer de udtryk for disse gener.
Den eksisterende protokoller2,3,4,5,6 til partikel bombardement og efterfølgende måling af forbigående genekspression er ganske arbejdsintensive, som hvert sæt bombarderet knap korn er homogeniseret i hånden i en morter og støder og enzym-assays skal foretages individuelt. Dette manuskript rapporterer en forbedret protokol, der delvist automatiserer og strømliner trinnet homogenisering og GUS-undersøgelser for at tillade betydeligt flere gennemløb, tillader et større antal behandlinger til testes i det samme eksperiment, og/eller den inddragelse af flere flergangsbestemmelser for hver behandling for at opnå mere statistisk solide resultater. Repræsentative resultater er vist for udtryk for HVA1 og Amy32b reporter konstruktioner, reguleret af transkriptionsfaktor TaABF1 samt af GA, ABA og andre regulerende molekyler.
Indførelsen af effektor gen konstruerer via partikel bombardement, efterfulgt af forbigående udtryk for reporter konstruktioner er en værdifuld strategi for dissekere rolle af særlige aktører i GA/ABA signalering og den resulterende hormon-reguleret gen udtryk.
Dog er eksisterende protokoller for at udføre sådanne forsøg i Byg aleurone celler2,3,4,5,6</su…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Greyson Butler og Margaret Barrett til hjælp ved udførelsen af eksperimenter, Judy Stone for rådgivning om korn homogenisering og Lynn Hannum for rådgivning om fluorometry. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (IOB 0443676), en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under grant nummer P20GM0103423, og tilskud fra Colby College Division af naturvidenskab.
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
stopping screens | BioRad | 1652336 | |
macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |