Mäta genuttryck i bombarderade korn Aleurone lager med ökad genomströmning

Summary

Ett förbättrat protokoll presenteras för mätning av transienta genuttryck från reporter konstruktioner i korn aleurone celler efter partikel beskjutning. Kombinationen av automatiserade spannmål slipning med plattan med 96 brunnar enzym analyser ger hög genomströmning för förfarandet.

Abstract

Det aleurone lagret av kornkorn är ett viktigt modellsystem för hormon-reglerat genuttryck i växter. I aleurone celler, gener krävs för grobarhet eller tidig fröplanta utveckling aktiveras av gibberellin (GA), medan gener associerade med stressreaktioner som aktiveras av abscisic syra (ABA). Mekanismerna i GA och ABA signalering kan förhöras genom att införa reporter gen konstruktioner i aleurone celler via partikel beskjutning, med resulterande övergående uttryck mäts med hjälp av enzymet analyser. Ett förbättrat protokoll rapporteras som delvis automatiserar och effektiviserar steget korn homogenisering och enzym analyserna, att låta betydligt mer dataflöde än befintliga metoder. Homogenisering av korn proverna görs med ett automatiserat vävnad Homogenisatorer och GUS (β-glukuronidas) analyser utförs med hjälp av ett system för plattan med 96 brunnar. Representativa resultat med hjälp av protokollet föreslår att fosfolipas D aktivitet kan spela en viktig roll i aktiveringen av HVA1 genuttryck av ABA, genom Transkriptionfaktorn TaABF1.

Introduction

Korn aleurone lagret är en väletablerad modellsystem för studier av hormon-reglerat genuttryck i växter¹. Ett antal gener som krävs för grobarhet eller tidig fröplanta utveckling är särskilt aktiveras av gibberellin (GA), medan gener associerade med stressreaktioner som aktiveras av abscisic syra (ABA). De GA och ABA signalering vägar är sammanflätade, som ett uttryck för vissa GA-aktiverade gener hämmas av ABA, och vice versa¹.

En värdefull strategi för att förstå rollen som vissa aktörer i GA/ABA signalering har varit införandet av effektor gen konstruktioner via partikel beskjutning, följt av övergående uttryck för reporter konstruktioner som tillåter den resulterande effekten på nedströms genuttryck som skall fastställas. Användning av reporter gener som GUS (β-glukuronidas) eller luciferas tillåter den känsliga och kvantitativa mätningen av genuttryck specifikt inom de celler som har fått den effektor konstruktion. Till exempel fastställs införandet av en effektor konstruktion kodning Transkriptionfaktorn TaABF1^5,6 att ABA-inducerad gener såsom HVA1 induceras av TaABF1, medan GA-inducerad gener som Amy32b förträngas. Partikel beskjutning som en experimentell strategi har använts av flera laboratorier för att undersöka olika aspekter av GA/ABA signalering. Sådant arbete har lett till identifiering av promotorn element viktigt för aktivering av både GA-inducerad² och ABA-inducerad gener³och till upptäckten av protein kinaser⁴ och transkription faktorer⁵ som reglerar den uttryck av dessa gener.

De befintliga protokoll^2,3,4,5,6 för partikel beskjutning med påföljande mätning av övergående genuttryck är ganska arbetskrävande, som varje uppsättning bombarderas knappt korn är homogeniserad för hand i en mortel och stöt och enzym analyserna utförs individuellt. Detta manuskript rapporterar ett förbättrat protokoll som delvis automatiserar och effektiviserar steget homogenisering och GUSEN analyser för att möjliggöra betydligt mer genomströmning, tillåter ett större antal behandlingar testas i samma experiment, eller den införandet av fler replikat för varje behandling för att få mer statistiskt robusta resultat. Representativa resultat visas för uttrycket av HVA1 och Amy32b reporter konstruktioner, regleras av Transkriptionfaktorn TaABF1 samt av GA, ABA och andra reglerande molekyler.

Protocol

1. beredning av effektor och Reporter gen konstruerar Bygg effektor konstruktioner som sysselsätter en konstitutiva promotorn (t.ex. majs ubiquitin, UBI) till drive uttryck från en önskad öppen läsning ram. Till exempel konstruera en plasmid som innehåller UBI::TaABF1 att driva starkt konstitutiva uttryck av TaABF15. Bygga reporter konstruktioner som inkluderar arrangören vars verksamhet är att mätas, placeras uppströms en öppen läsning ram, såsom…

Representative Results

Den teknik som beskrivs här kan användas för att införa någon test gen konstruktion i aleurone celler av kornkorn. Uttryck från test-genen kan sedan vara bekvämt mätt (figur 2). Det högre genomströmning-protokollet som beskrivs här kraftigt ökar effektiviteten av utsäde slipning och enzym analysstegen. Denna metod har använts för att bedöma transkription faktorn TaABF15,6 förmåga att…

Discussion

Införandet av effektor gen konstruerar via partikel beskjutning, följt av övergående uttryck för reporter konstruktioner är en värdefull strategi för dissekera rollen som vissa aktörer i GA/ABA signalering och i den resulterande hormon-reglerade genen uttryck.
Befintliga protokoll för att genomföra sådana experiment i korn aleurone celler^{2,3,4,5,6</su…}

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800